陳奕微,遲紹琴*,孫宇飛

(1.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院,廣東 深圳518172;2.深圳華僑城醫(yī)院)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏癥是最常見的遺傳性紅細胞酶缺乏病,該酶活性的降低或缺乏易引發(fā)遺傳性溶血性疾病,臨床主要表現(xiàn)為急性溶血、遺傳性非球形細胞性溶血性貧血、新生兒高膽紅素血癥、無癥狀攜帶者等。

目前診斷G6PD缺乏癥普遍采用酶活性測定手段,如G6PD活性直接測定、G6PD/6PGD比值法等。這些方法雖然簡便、快捷、廉價,但由于女性雜合子患者的G6PD活性往往正?；蚺R界值,現(xiàn)有的臨床檢測方法對女性雜合子的檢測存在漏診現(xiàn)象[1,2]。所以通過對G6PD 缺陷癥的篩查,進一步分子診斷對于指導優(yōu)生優(yōu)育,提高出生人口素質(zhì)顯得極為重要。本研究旨在通過研究葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因在深圳市龍崗區(qū)孕前人群中的主要突變類型、分布特點及表型,為該病在本地區(qū)的診斷及預(yù)防提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2015年3月至 2016年12月間參與龍崗區(qū)免費孕前優(yōu)生健康檢查10075名體檢者的血標本(采集肘靜脈血標本2 ml于EDTA抗凝采血管中),包括5027名男性,5048名女性。部分需要復核的標本在獲得患者的知情同意之后,重新采集。新鮮全血用于酶活性檢測,其余全血保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性檢測

采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)測定試劑盒(廣州科方醫(yī)療器械有限公司,廣州)于深圳邁瑞B(yǎng)S-800全自動生化分析儀進行G6PD/6PGD比值測定,嚴格按照試劑說明書操作。結(jié)果判讀,成人活性正常者1.0-2.3,G6PD缺乏<1.0。

1.3 基因組DNA提取

采用血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(廣東凱普生物科技股份有限公司,廣州)進行基因組DNA抽提,嚴格按照試劑說明書操作,獲得的DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測

對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性檢測初篩陽性樣本437例(G6PD/6PGD比值<1),以及隨機挑選G6PD/6PGD陰性樣本535例進行葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測。

利用GeneAmp PCR System 9700擴增儀對DNA產(chǎn)物進行擴增,并利用醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(潮州凱普生物化學有限公司,廣州)及潮州凱普生物化學有限公司生產(chǎn)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測試劑盒(PCR+導流雜交法)檢測 14個中國人常見G6PD基因突變位點,分別為:c.95A>G、c.392G>T、c.493A>G、c.487G>A、c.592C >T、c.1311C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.871G >A、c.1004C>T、c.1024C>T、c.1387C>T、c.1388 G>A。嚴格按照試劑說明書操作,觀察膜條上出現(xiàn)的藍紫色斑點,進行結(jié)果判讀。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料以百分數(shù)(%)表示,組間比較采用χ2檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 G6PD缺乏癥酶學篩查結(jié)果

龍崗區(qū)孕前人群G6PD缺乏癥酶G6PD/6PGD比值法篩查的10075例孕前優(yōu)生檢查標本中,初篩陽性標本共437例,酶活性異常檢出率為4.34%。其中男性228例(4.54%)、女性209例(4.14%),男,女陽性率比較χ2=0.546,P值為0.46>0.05,無統(tǒng)計學差異。

2.2 G6PD基因突變檢測結(jié)果

對977例樣本進行G6PD基因突變檢測。芯片膜條探針位置以及代表性檢測結(jié)果圖1所示。

A：芯片探針位置示意圖；B：代表性檢測結(jié)果

2.3 基因檢測結(jié)果

PCR+導流雜交法檢測結(jié)果顯示：972例(437例酶學篩查陽性樣本及535例酶學陰性樣本：女性樣本374例,男性樣本161例)進行基因檢測的樣本中,共檢出突變標本664例。酶學篩查陽性樣本基因異常檢出率為97.25%,酶學陰性樣本基因異常檢出率為44.67%,見表1酶學篩查與G6PD基因突變檢測結(jié)果統(tǒng)計。

表1 酶學篩查與G6PD基因突變檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.4 基因突變類型

此次檢測共檢出單點突變類型9種,含有195例c.1376G>T(29.37%),171例c.1388 G>A(25.75%),102例c.1311C>T(15.36%),67例c.95A>G(10.09%),27例c.1024C>T(4.07%),21例c.392G>T(3.16%),6例c.1360C>T(0.90%),c.487G>A及c.592C>T分別檢測出1例；共檢出復合突變73例(男13例,女60例)12種,含有28例G6PD文昌型c.871G>A/c.1311C>T(4.22%),18例c.1311C>T/c.1376G>T(2.71%),8例c.1311C>T/c.1388G>A(1.20%)等。此外,復合突變種包含兩種三重復合突變,為c.871G>A/c.1311C>T/c.1388 G>A及c.871G>A/c.1311C>T/c.1376G>T,分別檢出2例及1例；239例酶學篩查陰性而基因檢測陽性標本中,男性28例均為c.1311C>T突變,女性則是多種突變類型,有單點突變和復合突變,其中,c.1311C>T突變?yōu)?3.65%(雜合突變64例純合突變7例)。664例樣本G6PD基因突變類型統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 664例樣本G6PD基因突變類型統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏是X染色體連鎖不完全顯性方式遺傳,其基因定位于Xq28。由于X染色體的伴性遺傳,男性只有一條X染色體,當其帶有G6PD缺乏癥的致病基因時,稱為半合子。當女性兩條染色體都帶有致病基因,稱為純合子；僅一條X染色體帶有致病基因,稱之為雜合子。在G6PD缺乏癥篩查中,半合子的男性和純合子女性及大多數(shù)雜合子女性的酶活性降低,均可以通過G6PD酶活性測定被檢測到,但不能有效檢出女性雜合子[3]。國內(nèi)外研究早就證實G6PD基因突變雜合子是可以發(fā)病的[4]。因此G6PD 缺乏癥女性雜合子的分子水平檢測具有重要意義。

本研究中,采用傳統(tǒng)酶學技術(shù)篩查深圳龍崗區(qū)孕前人群G6PD缺乏癥發(fā)病率約為4.34%,男性4.54%,女性4.14%。G6PD/6PGD比值法篩查的10075例孕前優(yōu)生健康檢查標本中,男、女性檢出率無明顯區(qū)別(P>0.05)。女性雜合子G6PD酶活性變化較大,表現(xiàn)范圍從正常至完全缺乏,該結(jié)果與其他報道一致[5]。對女性樣本基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),G6PD酶活性陽性組,基因檢測陽性率為96.65%,而酶學陰性的基因檢測陽性率為56.42%,提示應(yīng)用傳統(tǒng)酶活檢測女性雜合子漏檢嚴重。

現(xiàn)已確定全世界超過180多種G6PD基因突變與G6PD缺乏癥有關(guān),中國已發(fā)現(xiàn)35種點突變[6]?？捎糜贕6PD基因突變診斷的技術(shù),目前有等位基因特異性寡核苷酸探針(ASO)、限制性酶切片段多態(tài)性(RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)以及DNA測序分析等。這些方法比較復雜,不適用于大面積的普查和快速診斷。國內(nèi)尚缺乏對于G6PD缺乏癥的大規(guī)模分子流行病學研究。本實驗采用導流雜交技術(shù)檢測樣本G6PD基因6個外顯子上14個常見突變位點,共檢出21種突變類型,包含多種復合突變。共檢測出10個位點的變異,分別為:c.95A >G、c.392G>T、c.487G>A、c.592C>T、c.1311C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.871G>A、c.1024C>T及c.1388G>A,該地區(qū)常見突變型為c.1376G>T、c.1388G>A、c.1311C>T、c.95A>G,與文獻報道這幾種基因型為臨床常見型別一致[6]。除了102例c.1311C>T突變多態(tài)性外,c.1311C>T的復合突變類型廣泛,提示該群體內(nèi)1311多態(tài)性具有差異,主要以c.871G>A/c.1311C>T(28例)、c.1311C>T/c.1376G>T(18例)和c.1311C>T/c.1388G>A(8例)三種類型為主,女性復合突變多于男性。

對孕前、已懷孕夫婦進行G6PD缺乏癥產(chǎn)前篩查和/或分子診斷,可以及早發(fā)現(xiàn)雜合子型女性G6PD缺乏者,有利于指導臨床醫(yī)生對該類孕婦正確用藥,避免醫(yī)源性損傷；為攜帶G6PD基因突變的夫婦提供遺傳咨詢和優(yōu)生優(yōu)育指導建議,及早對子代進行酶活性或基因檢測,減輕G6PD缺乏癥對新生兒造成的危害。本研究結(jié)果提示,分子水平的基因檢測可以顯著提高女性雜合子G6PD缺陷癥的檢出率,將有助于解決女性雜合子G6PD缺陷漏檢的情況發(fā)生。

作者簡介：陳奕微,女，38歲，臨床醫(yī)學檢驗主管技師，研究方向：臨床醫(yī)學生化免疫。

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