李怡沅，陳恒，苗瑞雪，李偉然，程悅，萬朝敏，朱渝*

(1. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科，出生缺陷與相關(guān)幼兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都　610041； 2. 成都市疾病預(yù)防控制中心，成都　610041； 3. 四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，成都　610041)

手足口病好發(fā)于嬰幼兒及兒童，輕癥表現(xiàn)為手、足、口腔等皮膚黏膜的斑疹、皰疹和/或皰疹性咽峽炎，可自愈，重癥可引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、小腦腦炎、急性遲緩性麻痹等。手足口病主要病原為EV71和CoxA16，其中EV71可引起嚴(yán)重的神經(jīng)并發(fā)癥，甚至死亡[1]。自 1969年美國加利福尼亞州首次發(fā)現(xiàn)EV71病毒以來，全球范圍內(nèi)均有流行，且近年亞太地區(qū)的發(fā)病率有增加趨勢[2]；在2009年中國大流行期間，手足口病患者多達(dá)百余萬例，其中死亡病例達(dá)三百多例[3]。手足口病成為我國兒童的重要疾病負(fù)擔(dān)之一。

由于重癥手足口病的嚴(yán)重不良預(yù)后，相關(guān)學(xué)者對此展開了的大量研究，但是目前關(guān)于EV71引發(fā)重癥的發(fā)病機(jī)制尚未明確。我們的研究采用成都市地區(qū)不同臨床結(jié)局的EV71病毒分離株，在小鼠動(dòng)物模型上進(jìn)一步探索其毒力情況，為重癥手足口的發(fā)生機(jī)制提供新的資料。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18～21日齡的SPF級BALB/c臨產(chǎn)孕鼠32只，購自四川省簡陽達(dá)碩科技有限公司【SYXK(川)2014-189】，每只孕鼠產(chǎn)乳鼠6～10只，出生體重1.2～1.8 g, 飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西動(dòng)物服務(wù)站【SCXK(川)2013-026】，母鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，乳鼠每窩單籠母乳喂養(yǎng)。本研究通過四川大學(xué)華西第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(201219)。

1.1.2病毒株及培養(yǎng)

EV71病毒分離株由成都市疾控中心提供。臨床標(biāo)本采集自2011～2014年成都市疑似手足口病患兒的咽拭子，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診為EV71感染，其臨床結(jié)局分別為輕癥(2014-29)、重癥(2011-100)及死亡(2012-227)。標(biāo)本以Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，觀察細(xì)胞病變并以熒光PCR確定, 2014-29 1×1010TCID50/mL，2011-100 1.78×108TCID50/mL，2012-227 5.88×109TCID50/mL。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

RNAprep Pure Tissue Kit RNA(DP431)，Diagnostic Kit for Enterovirus 71 RNA，DU730 Nucleic Acid / Protein Analyzer(Beckman，美國)，CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad，美國)，Centrifuge 5417R (Eppendorf, 德國)。

1.2　方法

1.2.1動(dòng)物接種

實(shí)驗(yàn)分4組，每組8只孕鼠，乳鼠1日齡時(shí)腹腔接種。1～3組為實(shí)驗(yàn)組，分別接種29號、100號和227號病毒液0.1 mL，4組為對照組接種生理鹽水0.1 mL，感染當(dāng)天記為0 d。每組的小鼠4籠用于觀察臨床癥狀，4籠用于解剖采集標(biāo)本。

1.2.2臨床癥狀

觀察組的乳鼠，接種前及接種后每日記錄其體重、生存情況及臨床癥狀評分，觀察周期為14 d。臨床評分標(biāo)準(zhǔn)為0分：健康；1分：皮疹、毛發(fā)豎起、皺皮或/和駝背；2分：活動(dòng)減少、四肢乏力；3分：肢體顫抖；4分：肢體癱瘓；5分：呼吸急促、窘迫；6分：瀕死或死亡。臨床癥狀評分采用盲法，由兩位實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立完成。

1.2.3組織取材

用于解剖的四組乳鼠，于接種后第1、3、5、7和9天，麻醉后取其腦、肺、肝、脾、腸和肌肉組織，每只取材2份，1份 -80℃儲(chǔ)存，檢測病毒載量；1份用于蘇木素尹紅(HE)病理切片。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取材來源于3只乳鼠。

1.2.4病理切片

組織經(jīng)4%的多聚甲醛浸泡，石蠟包埋，經(jīng)蘇木素尹紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變，病理讀片由專業(yè)的病理醫(yī)師完成。

1.2.5RNA提取及病毒載量檢測

將儲(chǔ)存的組織置于冰面上緩慢解凍，稱取10～20 mg液氮研磨成勻漿，按RNA提取試劑盒步驟完成提取，核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測組織中病毒載量。樣品判斷方法：檢測樣品 Ct 值≤38，且曲線有明顯的擴(kuò)增曲線，為EV71陽性；無擴(kuò)增曲線或Ct值>38，為EV71陰性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，稀釋后獲取濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入及整理，SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5.0進(jìn)行繪圖。采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生存率比較采用log-rank test，P< 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多個(gè)樣本的兩兩比較采用Bonferoni法。

2　結(jié)果

2.1　臨床癥狀

2.1.1體重

接種前4組體重差異無顯著性(P=0.441 > 0.05)。根據(jù)體重增長曲線，接種后1～5 d，4個(gè)組體重增長趨勢相近，第5天時(shí)各組體重差異無顯著性(P=0.255 > 0.05)；第6～8天，實(shí)驗(yàn)組開始出現(xiàn)體重增長緩慢，輕癥株組(29號)最緩慢，死亡株組(227號)較重癥株組(100號)快；第9天開始，輕癥株組和重癥株組的體重出現(xiàn)快速增長，而死亡株組體重增長較前放緩。分析14 d觀察期內(nèi)各組的平均體重，4組間體重差異有顯著性(P=0.000 < 0.05)，重癥株組、死亡株組與對照組的體重差異無顯著性(P=0.037 > 0.05/6，P=0.276 > 0.05/6)；輕癥株組與重癥株組、死亡株組的體重差異有顯著性(P=0.002 < 0.05/6，P=0.000 < 0.05/6)，即輕癥株組體重增長較另外3個(gè)組慢(見圖1)。

圖1　平均體重增長曲線Fig.1　The curves of average weight growth

2.1.2臨床癥狀評分

對照組評分波動(dòng)在1～3分間，第10天后評分下降接近0，實(shí)驗(yàn)組，第2天出現(xiàn)癥狀評分的高值后下降，在第5天后3個(gè)組的癥狀又開始加重，在第8～10天時(shí)出現(xiàn)癥狀的高峰，后逐漸恢復(fù)。4組間臨床癥狀評分差異有顯著性(P=0.000 < 0.05)，其中3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000)，重癥株組與輕癥株組差異無顯著性(P=0.693)，死亡株組分別與重癥株組、輕癥株組的差異有顯著性(P=0.000，P=0.000)，即重癥株與輕癥株接種小鼠后，癥狀嚴(yán)重程度無差異，且兩組的臨床癥狀較死亡株組的重(見圖2)。

圖2　臨床癥狀評分圖Fig.2　Score values of clinical performance of the mice

2.1.3生存率

死亡株組小鼠在接種后第1、2天出現(xiàn)死亡，其中第2天重癥組亦有死亡，接種第6天后，輕癥和重癥株組陸續(xù)出現(xiàn)死亡，輕癥、重癥和死亡株組的生存率分別為77.2%，81.7%和97.8%。4組生存率差異有顯著性(P< 0.0001)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組生存率差異有顯著性(P< 0.0001)，重癥株組與輕癥株組差異有顯著性(P=0.0010 < 0.05)，死亡株組與重癥株組、輕癥株組差異有顯著性(P=0.001 < 0.05，P=0.0004 < 0.05)，即死亡株組生存率最高，輕癥株組的生存率最低(見圖3)。

圖3　生存率曲線Fig.3　Survival curves of the mice

2.2　HE病理結(jié)果

肺組織 輕癥株組肺出血較重癥株組和死亡株組重：輕癥株組感染后肺泡腔內(nèi)大量紅細(xì)胞，肺泡上皮部分壞死脫落，第3天出現(xiàn)肺實(shí)變(圖4)，第5天肺內(nèi)大量血漿蛋白滲出；重癥株組感染后第1天肺出血最嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)大量紅細(xì)胞，肺泡上皮部分壞死脫落；死亡株組肺泡腔內(nèi)少量-中量紅細(xì)胞，肺泡上皮部分壞死脫落(圖5)。

肝病變輕癥株組和重癥組較死亡組重，以第1天病變明顯：輕癥株組與重癥株組肝細(xì)胞彌漫中-重度水腫，并可見多核巨細(xì)胞增生，伴中量炎細(xì)胞浸潤；死亡株組肝細(xì)胞彌漫中度水腫，并可見多核巨細(xì)胞增生，伴少-中量炎細(xì)胞浸潤(圖7)。

腦、肌肉、脾、腸3組感染后各時(shí)間段腦組織、肌肉、脾和腸組織定性差異無顯著性。腦組織出現(xiàn)腦神經(jīng)纖維排列紊亂，以及微小液化性壞死灶后出現(xiàn)篩網(wǎng)狀改變，神經(jīng)元凝固凋亡，小膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖6)。肌肉組織第7天表現(xiàn)為明顯的肌肉炎癥：肌纖維卷曲、部分溶解，束膜溶解破裂，細(xì)胞核排列紊亂，肌間可見較多炎細(xì)胞浸潤；腸和脾的病變程度較輕，脾內(nèi)見多核巨細(xì)胞，部分色素沉著；腸黏膜間見少量紅細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤(圖7)。

圖4　輕癥毒株肺上皮細(xì)胞壞死脫落及肺實(shí)變(HE染色，×200)Fig.4　Shedding of necrotic pulmonary epithelial cells and lung consolidation of mild strain (HE staining, ×200)

注：29：輕癥毒株；100：重癥毒株；227：死亡毒株；con:對照組。圖5　各組不同時(shí)間肺出血情況(HE染色，×200)Note. 29: Mild strain；100：Severe strain；227：Fatal strain；Con：Control.Fig.5　Pulmonary hemorrhage at different time points in the mouse groups(HE staining, ×200)

注：29：輕癥毒株；100：重癥毒株；227：死亡毒株；con:對照組。圖6　各組不同時(shí)間腦組織病理改變(HE染色，×200)Note. 29: Mild strain.100: Severe strain.227: Fatal strain.Con: Control.Fig.6　Pathological changes of brain tissues at different time points in the mouse groups in each group (HE staining, ×200)

注：29：輕癥毒株；100：重癥毒株；227：死亡毒株；con:對照組。圖7　組織病理改變(HE染色)Note.29: Mild strain；100: Severe strain; 227: Fatal strain; Con: Control.Fig.7　Pathological changes of different organ tissues in the mouse groups(HE staining)

2.3　組織病毒載量

各組織中以肝和肌肉中的病毒載量較其他組織高，輕癥株組、重癥株組和死亡株組肝組織分別在第5天(105.85copies/mL)、第3天(104.91copies/mL)和第5天(103.53copies/mL)達(dá)到其高峰，肌肉組織分別在第7天(106.49copies/mL)、第5天(106.77copies/mL)和第5天(103.98copies/mL)達(dá)到高峰；腦組織中病毒的載量在接種后較其他組織低，隨著時(shí)間推移，輕癥株組、重癥株組和死亡株組分別在第7天(103.22copies/mL)、第5天(103.75copies/mL)和第5天(102.50copies/mL)達(dá)到高峰。死亡株組織中病毒載量在接種后第1天較高，第3天下降后第5天再次增加，第7天后下降至第9天僅肝檢測出病毒；而輕癥株組和重癥株組組織中濃度則逐漸增加，在5～7 d達(dá)到高峰，第9天下降(圖8)。

注：A：29號輕癥病毒組；B：100號重癥病毒組；C：227號死亡病毒組。圖8　接種后不同時(shí)間組織中病毒載量Note. A: 29-mild strain; B: 100-severe strain; C: 227-fatal strain.Fig.8　Virus titer of tissues at different time points post-infection of the groups

接種后各時(shí)間段內(nèi)不同組組織中的病毒載量，呈現(xiàn)輕癥株組高于重癥株組和死亡株組的趨勢，死亡株組的病毒載量低，但在第5天時(shí)，輕癥株組肝、脾、肺、腸中的載量最高，而重癥株組腦和肌肉中的較其他兩組高；第9天時(shí)，死亡株組僅肝檢測出病毒，輕癥株組肝和肌肉中的病毒較重癥株組高，脾、肺、腸、腦中的病毒載量，兩組相近(圖9)。

圖9　各組不同時(shí)間組織病毒載量Fig.9　Virus titers in different organ tissues of the mouse groups at different time points post-infection

3　討論

EV71是單股正鏈RNA病毒，屬于腸道病毒科，為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突起，直徑約為24～30 nm，由外層的衣殼和RNA核心構(gòu)成[4]。EV71的衣殼是由有四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的五聚體，即VP1、VP2、VP3、VP4[4-5]，分A、B、C三個(gè)基因型；根據(jù)VP1序列變異程度進(jìn)一步分為11個(gè)亞型，即A、B1～B5和C1～C5[6]，不同時(shí)期，不同地區(qū)流行的病毒株亞型不同，從1973～2008年期間亞太地區(qū)B1～B5和C1～C5都有流行，近年中國的病毒株主要以C4型為主，臺(tái)灣地區(qū)C4、C5和B5均有流行[7]。國內(nèi)關(guān)于EV71的研究也很多，但對臨床病毒株以動(dòng)物進(jìn)行毒力探索的研究較少；且不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇或/和相同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同的年齡，所獲得的結(jié)果都是不同的；流行的病毒株受地域的影響，國內(nèi)西南地區(qū)關(guān)于EV71毒力的動(dòng)物研究更是匱缺。本研究以成都市地區(qū)流行的不同毒力株，在BALB/c新生鼠上進(jìn)一步探求引起不同臨床表現(xiàn)的機(jī)制，同時(shí)豐富了本地區(qū)的相關(guān)資料。

本研究中3株病毒在108～10TCID50/mL間，接種不同的臨床毒株后，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)肢體麻痹、死亡，病理檢測出現(xiàn)腦炎、肌肉炎癥、肺出血和肝細(xì)胞水腫，成功建立EV71的感染模型。對照組的評分波動(dòng)于1～3分間，第10天后評分逐漸降低，接近0，與既往研究中對照組評分均為0的情況有所不同[8-9]。本研究癥狀評分采用盲法，實(shí)驗(yàn)員不知病毒臨床毒力情況，每日評分時(shí)僅提供每窩鼠的編號，未知接種的病毒種類，且整個(gè)評分過程由兩位實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立完成，減少偏倚。對照組觀察到乳鼠的疑似駝背、乏力、顫抖的癥狀，考慮可能與乳鼠神經(jīng)系統(tǒng)與運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)發(fā)育不完善有關(guān)，繼而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)不穩(wěn)的相關(guān)癥狀；且癥狀隨著日齡的增加，相關(guān)癥狀逐漸減弱，至14 d時(shí)逐漸消失。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對照組的評分與3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有差異，進(jìn)一步證明對照組的這種癥狀與病毒接種后出現(xiàn)的癥狀是不同的。實(shí)驗(yàn)組在接種后第2天出現(xiàn)一過性癥狀評分高值，在第5天后癥狀又開始加重，在第8～10天時(shí)出現(xiàn)癥狀的高峰，后逐漸恢復(fù)?？紤]其發(fā)生可能與病毒的感染機(jī)制有關(guān)：EV71感染時(shí)首先在患者扁桃體、腸道潘氏結(jié)等淋巴組織中復(fù)制，進(jìn)一步侵入鄰近淋巴組織中大量復(fù)制，造成輕度病毒血癥，從而引起接種第2天的癥狀評分較高，此階段大部分EV71自然痊愈，呈輕癥表現(xiàn)；而未得到控制的EV71在體內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)散，侵及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(肝、脾、骨髓和淋巴結(jié))、心臟、肺、胰腺、皮膚、黏膜，甚至危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)相關(guān)癥狀[10]，解釋了第5天后出現(xiàn)癥狀的再次加重，達(dá)到癥狀的高峰的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組體重增長緩慢的出現(xiàn)、嚴(yán)重癥狀的發(fā)生、組織中聚集較高的病毒濃度出現(xiàn)在5 d以后，輕癥組和重癥組在6 d后出現(xiàn)死亡，嚴(yán)重程度在時(shí)間上一致，且與國內(nèi)的研究基本相符。BALB/c 1日齡的乳鼠接種不同毒力的EV71病毒株，感染后3 d體重增長速度減慢，5 d出現(xiàn)后肢癱瘓，7 d時(shí)全部死亡[11]；10日齡的BALB/c小鼠研究，在感染后4 d出現(xiàn)癥狀[12]。

病理讀片由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師完成，肺出血在對照組均表現(xiàn)為少量紅細(xì)胞，可能為解剖操作等因素所致，而實(shí)驗(yàn)組肺泡腔內(nèi)出血的程度為大量、中量和少-中量，在相同人員操作將干擾因素所致出血控制在肺泡腔內(nèi)少量紅細(xì)胞的情況下，可以得出實(shí)驗(yàn)組的肺出血由病毒導(dǎo)致。肝病變在實(shí)驗(yàn)組與對照組均有多核巨細(xì)胞的增生，但實(shí)驗(yàn)組和對照組在炎細(xì)胞累及上有差異，輕癥株組與重癥株組中量炎細(xì)胞浸潤，死亡株少-中量炎細(xì)胞浸潤，對照組呈現(xiàn)少量炎細(xì)胞。肌肉第7天病變明顯，實(shí)驗(yàn)組肌纖維卷曲、部分溶解，束膜溶解破裂，細(xì)胞核排列紊亂，肌間可見較多炎細(xì)胞浸潤，對照組與實(shí)驗(yàn)組病理改變有差異，主要呈現(xiàn)部分卷曲改變,考慮受解剖剝離等因素影響。

本研究中肝和肌肉中病毒載量較其他組織高，EV71在鼠具有較強(qiáng)的肌肉嗜性[13- 14]，適應(yīng)株病毒的研究在肝、脾、肺、肌肉和腦中均檢測出病毒，其中肌肉中的病毒載量最高[15]。腦組織接種后病毒量低，5～7 d時(shí)達(dá)到其峰濃度，7 d鼠口服模型的研究亦發(fā)現(xiàn)，接種后腦組織濃度未檢出，在5 d時(shí)最高[14]，與本研究結(jié)果相符。死亡毒株組織中病毒量在接種后第1天較高，第3天下降，第5天達(dá)高峰，第9天后僅肝檢測出病毒。有研究發(fā)現(xiàn)感染后1 d和5 d為病毒感染的高峰期，3 d為一個(gè)低谷，7 d載量下降后不再上升，9 d時(shí)均沒有病毒檢出[16]，與本研究中死亡株的趨勢一致。其發(fā)生與病毒侵入機(jī)制有關(guān)，病毒進(jìn)入后首先大量復(fù)制出現(xiàn)第1次高峰，隨后因機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別下降，適應(yīng)后的病毒再次大量復(fù)制達(dá)到第2次高峰，后因鼠免疫系統(tǒng)的成熟完善而被清除，最終組織中不能檢測出。

本研究中，輕癥組小鼠的體重增長最緩慢，臨床癥狀比死亡組重，死亡率最高(22.8%)，接種后各個(gè)時(shí)間段組織中的病毒量更高，病理切片示肺出血最重；重癥組在臨床癥狀、死亡率和組織中病毒量方面，均較死亡組重。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BALB/c乳鼠臨床輕癥病毒株毒力最強(qiáng)，死亡病毒株的毒力最弱，與人臨床結(jié)局相反。其他的研究亦有類似的發(fā)現(xiàn)，不同臨床毒株在小鼠實(shí)驗(yàn)中生存率不存在差異[17]；體外研究發(fā)現(xiàn)，不同臨床來源的病毒在細(xì)胞增殖特性和毒力方面差異不大[11]。不同臨床病毒株是否因?yàn)槎玖Φ牟町惗鴮?dǎo)致不同的臨床結(jié)局，目前尚無定論，考慮可能與病毒基因、宿主及免疫狀態(tài)綜合影響相關(guān)。病毒基因變異的研究發(fā)現(xiàn)5′非翻譯區(qū)的幾個(gè)核苷酸與病毒毒力相關(guān)[18]；核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)被證明和RNA病毒的翻譯有關(guān)[19]，該區(qū)域核苷酸的變化導(dǎo)致RNA二級結(jié)構(gòu)變化，從而可能影響病毒翻譯；VP1是負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的主要蛋白質(zhì)，其區(qū)域氨基酸變化影響病毒和細(xì)胞受體之間的相互作用，從而可影響病毒致病性，動(dòng)物和臨床研究表明，VP1第710位的脯氨酸增加EV71毒力[18, 20-21]；此外，高度保守的VP1A107結(jié)構(gòu)與EV71成熟相關(guān)，進(jìn)而影響病毒的感染能力[22]。此外，本實(shí)驗(yàn)毒株進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：與疫苗株相比，基因同源性為95.12%～96.06%，其中同源性最高為重癥毒株(96.06%)，最低為輕癥毒株(95.12%)；VP1進(jìn)化樹顯示，所有毒株均為C4亞型，除輕癥毒株外，其余毒株均位于同一分支上；蛋白預(yù)測VP1二級結(jié)構(gòu)存在蛋白結(jié)合位點(diǎn)差異，三級結(jié)構(gòu)基本一致，即不同臨床結(jié)局EV71毒株存在基因的差異，可能存在相關(guān)毒力影響因素或關(guān)鍵位點(diǎn)(相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)表中)。

不同臨床來源的毒株在小鼠上呈現(xiàn)不同反應(yīng)，其結(jié)果與人的臨床結(jié)局不一致，輕癥毒株最嚴(yán)重，死亡毒株最輕，可能與病毒基因差異、宿主因素相關(guān)，關(guān)于病毒毒力的機(jī)制，需要更多的研究。