董黎明，呂靜薇，姜寧，陳善廣，劉新民,2,3*

(1. 中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京　100193； 2. 中國航天員科研訓練中心人因工程重點實驗室，北京　100094； 3. 湖南中醫(yī)藥大學，長沙　410208)

大鼠神經元的發(fā)育不僅在胚胎期，在出生后以及整個生命過程中都存在[1-2]。因此，大鼠腦發(fā)育老化程度與生長發(fā)育階段有關，處于不同腦發(fā)育階段的大鼠，其認知功能可能存在差異。對于大鼠發(fā)育年齡段的劃分有不同的文獻報道，從腦功能發(fā)育的角度，一般可將0～2個月齡劃分為發(fā)育早期(幼年期)大鼠，將2～12個月齡稱為青壯年期(成年期)大鼠，12個月齡以后為衰退期(老年期)大鼠[3-4]。

研究表明，大鼠進入老年期的學習記憶能力下降已成為眾所周知的事實。王暖等[5]發(fā)現24月齡的老年大鼠在Y-型電迷宮中，學習記憶能力顯著性降低，具體表現為學習嘗試次數增加、躲避電擊的正確次數顯著性減少。郭德玉等[6]使用幼鼠、青壯年鼠和老年鼠進行水迷宮和曠場分析法，實驗結果顯示青壯年大鼠學習記憶能力及對新異環(huán)境的適應性均強于幼年及老年大鼠。然而，腦發(fā)育過程中的幼年期、青年期與成年期大鼠的興趣、注意力、辨識決策、執(zhí)行操作等高級認知功能是否存在差異，卻鮮有報道。

認知是機體認識和獲取信息、知識的智能加工過程，是成功完成活動最重要的心理條件，具體包括知覺、注意、學習記憶、思維、決策、興趣、執(zhí)行能力等[7-8]。在腦機制研究中，獎勵性操作條件反射是一種較為高級的條件反射活動，可用于評價興趣、注意力、學習記憶、決策能力、執(zhí)行能力等多種認知功能研究[9-11]。因此，本研究采用了1月齡、2月齡和8月齡的大鼠進行獎勵性操作條件反射，評價不同腦發(fā)育階段大鼠的探索興趣、執(zhí)行操作和辨識能力等認知功能的影響。同時，采用經典的Morris水迷宮考察空間學習記憶能力的差異。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

1月齡、2月齡和8月齡的SPF級雄性Wistar大鼠各8只，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司【SCXK(京)2012-0001】。實驗室保持安靜，溫度保持在23～25℃，12 h 照明/12 h 黑暗環(huán)境(8:30-20:30 亮燈)。動物自購入后飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所的屏障環(huán)境【SYXK(京)2013-0023】，先進行5 d的適應性飼養(yǎng)，期間給予標準飼料及純凈水本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

1.1.2實驗儀器

獎勵性操作式條件反射檢測分析處理系統(tǒng)和Morris水迷宮系統(tǒng)，均由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所與中國航天員科研訓練中心聯合研制。獎勵性操作式條件反射檢測分析處理系統(tǒng)的測試箱體由PVC板材制成(30 cm× 30 cm× 55 cm)，箱體頂部安裝有攝像裝置，可以實時監(jiān)控動物在測試箱內暗環(huán)境下的行為活動。計算機分析處理系統(tǒng)能夠向箱體發(fā)送信號指令，并自動分析處理實驗數據。Morris水迷宮系統(tǒng)的圓形水池是由不銹鋼制成，水池直徑130 cm，高60 cm，水溫(25±1)℃，計算機分析處理系統(tǒng)能夠監(jiān)控動物活動并自動分析處理實驗數據。

1.2　方法

1.2.1獎勵性操作條件反射[12]

(1)飲食限制與雙瓶喂養(yǎng)：連續(xù)限制動物飲食10 d，每天給予每只動物14～17 g，使動物體重達到正常飼養(yǎng)動物體重的80%～85%[13,14]。同時采用雙瓶喂養(yǎng)方式，每天給予每只動物 30 mL 飲用純水和 30 mL 8%蔗糖水。飲食限制和雙瓶喂養(yǎng)持續(xù)到實驗結束。(2)獎賞條件反射：進行連續(xù) 7 d的獎賞條件反射，藍色信號燈作為刺激信號，周期性的亮燈10 s，亮燈間隔為 30 s，每天訓練時間為20 min。當藍色信號燈亮時，獎賞裝置自動給予一滴20%蔗糖水，作為獎賞物質；進入間歇期后沒有獎賞物質的泵出。(3)操作條件反射：進行4 d的操作條件反射訓練，踏板保持伸出狀態(tài)。大鼠完成一次踏板操作后，藍色信號燈亮燈 10 s，同時給予一滴獎賞物質，每天訓練時間 30 min或在期間連續(xù)踏板50次即完成實驗過程。(4)視覺信號辨識：進行4 d的視覺信號辨識訓練，選定藍色為正確信號燈，紅色為錯誤信號燈；雙色燈交替亮燈，亮燈時間為 120 s，實驗時長 28 min。藍色信號燈亮，動物踩踏板時可獲得一滴獎賞物質，其他操作均為錯誤操作，無獎賞物質。

1.2.2Morris水迷宮[15]

按東西南北將水池劃分為 4 象限 (NE，SE，SW，NW)，向池中加入黑色墨汁，以保證目標準確識別。(1)定位航行實驗：將安全平臺固定在NE中心，水面下1.5 cm。每只大鼠每天訓練2次，每次選擇不同入水點將大鼠面向池壁放入水中，連續(xù)訓練5 d。設置檢測時間為 60 s 后，若大鼠在期間找到平臺則尋臺成功，記錄其潛伏期；若大鼠在期間未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為 60 s，將大鼠引至平臺并停留 10 s。(2)空間探索實驗：第6天撤去平臺，從SE象限入水，檢測其在 90 s 內穿臺次數、目標象限游程比和時間比等指標。

1.3　數據分析

2　結果

2.1　不同腦發(fā)育階段大鼠的探索興趣比較

如圖1所示，在獎賞條件反射訓練階段，隨著訓練天數的增加，三組大鼠的正確鼻觸次數和鼻觸總次數均呈現增加趨勢，錯誤鼻觸次數變化不明顯。1月齡和2月齡大鼠的探索興趣無明顯差異。1月齡大鼠的正確鼻觸次數、錯誤鼻觸次數、鼻觸總次數均顯著多于8月齡大鼠(P< 0.01)，表現出更強的探索興趣。三組大鼠的鼻觸正確率均隨著訓練天數的增加而增加，但組間比較未出現顯著性差異。經過7 d的訓練后，不同月齡的大鼠均能成功建立獎賞條件反射。

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖1　不同腦發(fā)育階段大鼠的探索興趣的比較Note. Compared with the 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.1　Comparison of exploration interest in the rats at different brain developmental stages

2.2　不同腦發(fā)育階段大鼠的執(zhí)行操作能力比較

由圖2可知，在操作條件反射訓練階段，1月齡和2月齡大鼠的執(zhí)行操作能力無明顯差異。不同月齡大鼠鼻觸總次數逐漸減少，并且1月齡大鼠的鼻觸總次數顯著高于8月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)。三組大鼠的踏板總次數和踏板準確率均隨訓練時間的延長呈現增加趨勢，1月齡大鼠踏板總次數顯著多于8月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)，1月齡大鼠的踏板準確率在Day 2和Day 3顯著大于8月齡大鼠(P< 0.05)，踏板準確率即鼻觸總次數與踏板總次數的比值，能夠體現大鼠執(zhí)行操作能力差異。大鼠首次做出踏板操作的時間即操作潛伏期，1月齡大鼠的操作潛伏期顯著低于8月齡大鼠(P< 0.05)，表示1月齡大鼠已成功建立信號燈-踏板操作-獎賞之間的聯系，并且執(zhí)行操作反應能力更加敏捷。以上結果表明，1月齡和2月齡大鼠的執(zhí)行操作能力、反應速率和準確率均優(yōu)于8月齡大鼠。

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖2　不同腦發(fā)育階段大鼠的執(zhí)行操作能力比較Note. Compared with the 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.2　Comparison of executive ability of the rats at different brain developmental stages

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖3　不同腦發(fā)育階段大鼠的視覺信號辨識能力比較Note. Compared with the 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.3　Comparison of visual recognition ability of the rats at different brain developmental stages

2.3　不同腦發(fā)育階段大鼠的視覺信號辨識能力比較

視覺信號辨識要求大鼠對視覺刺激信號進行聯想記憶，準確判斷正確和錯誤信號燈提示，然后進行相應的操作行為以獲得糖水獎勵，屬于難度較大的辨識和學習記憶模式[16]。大鼠對視覺信號辨識和記憶的準確程度，可以通過視覺信號辨識指數表示，視覺信號辨識指數=(正確踏板次數 - 錯誤踏板次數)/踏板總次數。圖3顯示在視覺信號辨識階段，1月齡和2月齡大鼠的視覺信號辨識能力無明顯差異。8月齡大鼠的獎賞次數、踏板總次數和視覺信號辨識指數均顯著低于1月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)。

2.4　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間學習能力比較

圖4顯示大鼠在Morris水迷宮中的空間學習能力。經過連續(xù)5 d的加強學習，大鼠逐漸縮短了找到安全平臺的總游程和時間。1月齡和2月齡大鼠的空間學習能力無明顯差異。8月齡大鼠的平均速度顯著大于1月齡大鼠，表明其具有更強的游泳運動能力(P< 0.05)；但是總游程和尋臺潛伏期顯著大于1月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)，即對安全平臺空間位置的記憶不夠準確，尋找過程更具有盲目性，需要游更長的游程和時間找到安全平臺。

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖4　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間學習能力比較Note. Compared with 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.4　Comparison of spatial learning ability of the rats at different brain developmental stages

注：與1月齡大鼠比較，**P < 0.01差異有顯著性。a.1月齡組；b.2月齡組；c.8月齡組。圖5　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間記憶能力和運動軌跡比較Note. Compared with the 1-month-old rats, **P< 0.01. a. 1-month-old group; b. 2-month-old group; c. 8-month-old group.Fig.5　Comparison of spatial memory ability and movement tracks of the rats at different brain developmental stages

2.5　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間記憶能力比較

在空間探索階段，撤去放置于水下的隱蔽安全平臺，考察大鼠的空間記憶能力。由圖5可知，1月齡和2月齡大鼠的空間記憶能力無明顯差異。與1月齡大鼠比較，8月齡大鼠的穿臺次數呈現減少趨勢，但未出現顯著性差異；8月齡大鼠在目標象限的游程比和時間比均顯著性減少(P< 0.01)。此外，運動軌跡圖顯示，1月齡和2月齡大鼠的運動軌跡主要集中在目標象限區(qū)域，而8月齡大鼠的運動軌跡雜亂，表明對安全平臺的空間位置記憶不準確。

3　討論

獎勵性操作條件反射是在經典條件反射的信號-條件性刺激之間加入操作行為，動物通過隨機發(fā)現、主動探索、獲得經驗、強化記憶最終形成條件反射，屬于聯想式學習記憶范疇[12,17-18]。相對于穿梭、跳臺、避暗等懲罰性認知功能評價方法，獎勵性操作條件反射避免了對動物的傷害性刺激，在獎勵性刺激與條件反射之間形成良性循環(huán)，易化條件反射的形成，也更加符合動物福利[19-20]。大鼠的鼻觸次數能夠反映出動物對獎賞物質的興趣程度以及對刺激信號的反應能力，而探索興趣和反應能力也是動物進行踏板操作的基礎[16]。實驗結果表明，在獎賞條件反射階段，與1月齡和2月齡大鼠比較，8月齡大鼠的正確鼻觸次數、鼻觸總次數等指標顯著性減小，鼻觸正確率未發(fā)生明顯變化，表明8月齡大鼠對獎賞物質的探索興趣降低，但不影響獎賞條件反射形成能力。在操作條件反射過程中，8月齡大鼠的踏板操作次數、踏板正確率等指標顯著性降低，踏板操作潛伏期延長，表明該組大鼠操作能力和準確率降低。在視覺信號辨識階段，8月齡大鼠的視覺信號辨識能力弱于1月齡和2月齡大鼠，獎賞獲得次數和辨識指數顯著性減小，表明視覺信號辨識相關的學習記憶功能出現減退。

Morris水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年代初提出并應用于認知功能研究的一種實驗手段[21-22]。該實驗是利用嚙齒類動物天生厭惡水環(huán)境，學習尋找固定位置的隱蔽安全平臺，從而形成穩(wěn)定的空間記憶?？臻g記憶是動物對周圍環(huán)境中空間信息進行加工而形成，是一種以“異我”為參照物的空間參考記憶(reference memory)，其儲存機制主要涉及海馬和大腦皮質等有關腦區(qū)[23-24]。在本實驗中，8月齡大鼠的平均速度大于1月齡和2月齡大鼠，具有更強的游泳運動能力。但是其到達安全平臺的總游程和尋臺潛伏期均顯著大于1月齡和2月齡大鼠，表明該組大鼠的空間學習能力減退。撤去安全平臺后，8月齡大鼠穿過平臺位置的穿臺次數、目標象限的游程比和時間比均降低，表明其對安全平臺的空間位置記憶不準確。

綜上所述，與8月齡成年期大鼠相比，幼年期和青年期大鼠具有更強的探索興趣、執(zhí)行操作和視覺信號辨識能力，以及空間學習記憶能力。雖然8月齡成年期大鼠的運動能力很強，但是認知功能出現了一定程度的減退。大鼠的認知功能隨著不同腦發(fā)育階段而發(fā)生變化，在進入老年期之前的成年期即呈現認知功能下降趨勢，該實驗為開展腦的發(fā)育老化過程及嚙齒類動物高級認知功能研究提供了行為學實驗的參考依據。