楊 波，陳曉峰，段媛媛，郭 燕

(1. 陜西省人民醫(yī)院骨科，陜西西安 710068；2. 西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710049)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是以骨量減少、骨質(zhì)量受損及骨強(qiáng)度降低，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。該病是中老年人的常見病、多發(fā)病，其導(dǎo)致的骨折是中老年人致殘、病死的主要原因。除年齡、絕經(jīng)、疾病和藥物等危險(xiǎn)因素外，吸煙也是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因之一[2]。早在1976年，DANIELL等[3]研究表明，相比不吸煙者，女性吸煙者絕經(jīng)后會(huì)出現(xiàn)更多的骨丟失(P<0.001)。吸煙已被證實(shí)為骨質(zhì)疏松的主要危險(xiǎn)因素之一，近期一項(xiàng)長(zhǎng)期流行病調(diào)查顯示：長(zhǎng)期吸煙會(huì)顯著增加骨疏松癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]。研究證明，青年男性吸煙者的骨密度減少，導(dǎo)致其老年時(shí)期骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[5]。然而目前并不清楚吸煙影響骨質(zhì)疏松癥的具體分子機(jī)制。

作為一種高通量全基因組基因表達(dá)定量技術(shù)，表達(dá)譜芯片已被廣泛應(yīng)用于多項(xiàng)生命科學(xué)研究領(lǐng)域[6-8]。然而傳統(tǒng)的表達(dá)譜分析多關(guān)注于簡(jiǎn)單的病例對(duì)照差異表達(dá)分析，忽略了環(huán)境因素的影響，存在一定局限性[9]。對(duì)比而言，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study, GWAS)進(jìn)行全基因組基因環(huán)境互作分析已被證明為一種有效挖掘環(huán)境相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)基因的方法，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于精神病、哮喘、帕金森、癌癥等復(fù)雜疾病的研究[10-12]。然而，單純的GWAS也存在假陽(yáng)性率高、價(jià)格昂貴等問(wèn)題。結(jié)合表達(dá)譜芯片和GWAS全基因組基因環(huán)境互作分析，克服了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的弊端，立足于大數(shù)據(jù)挖掘，有助于挖掘基因與環(huán)境互作機(jī)制，闡明疾病發(fā)生機(jī)制，提供新的藥物靶標(biāo)。遺憾的是，結(jié)合表達(dá)譜芯片及GWAS的基因環(huán)境互作分析，目前并未見諸報(bào)道。此外，關(guān)于骨質(zhì)疏松癥和吸煙相關(guān)的基因環(huán)境互作分析也屬于當(dāng)前研究空白。

在本研究中，我們首次結(jié)合表達(dá)譜芯片和GWAS進(jìn)行了吸煙與骨質(zhì)疏松癥互作分析，找出顯著關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)基因，并通過(guò)通路富集分析挖掘潛在的致病通路，進(jìn)一步驗(yàn)證了富集通路中的風(fēng)險(xiǎn)基因，最后對(duì)驗(yàn)證基因進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)分析。這一整合分析方法有助于解密吸煙影響骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)的分子機(jī)制，為相關(guān)藥物靶點(diǎn)開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料本研究涉及表達(dá)譜芯片和基因芯片數(shù)據(jù)挖掘。其中，Affymetrix HG-U133A表達(dá)譜芯片(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GSE13850)記錄了人外周血B細(xì)胞全基因組基因表達(dá)信息。共計(jì)40名高加索樣本，其中包含20名高骨密度及20名低骨密度樣本，高低骨密度樣本組均分別包含10名吸煙和10名非吸煙樣本。Affymatrix SNP 6.0基因型芯片(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap，phs000390.v1.p1)包含1 617名高加索人基因型信息(909 622個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn))，以及表型信息(髖部/脊椎骨密度、吸煙習(xí)慣、年齡、性別、身高、體質(zhì)量)，該數(shù)據(jù)用于全基因組基因環(huán)境互作分析(詳細(xì)統(tǒng)計(jì)見表1)。表達(dá)譜芯片和基因芯片數(shù)據(jù)是兩個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集。

表1 GWAS樣本統(tǒng)計(jì)Tab.1 Summary of GWAS samples

1.2方法

1.2.1表達(dá)譜芯片質(zhì)量控制 對(duì)于表達(dá)譜芯片，采用R語(yǔ)言Bioconductor庫(kù)(http://www.bioconductor.org/)相關(guān)包進(jìn)行質(zhì)控分析。首先，導(dǎo)入simpleAffy包(http://www.bioconductor.org/)并繪制質(zhì)控總覽圖，該圖包含質(zhì)控探針actin和GAPDH的3′/5′熒光信號(hào)比值、尺度因子、嵌入探針BioB是否檢出等關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)。依據(jù)包參考標(biāo)準(zhǔn)(探針比值actin<3，GAPDH<1，尺度因子處于正常范圍即輸出圖中藍(lán)色標(biāo)識(shí)區(qū)域，Bio能被檢出)剔除檢測(cè)指標(biāo)異常的樣本。其次，進(jìn)一步導(dǎo)入affyPLM包(http://www.bioconductor.org/)并繪制相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)箱線圖(RLE)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差箱線圖(NUSE)。如果RLE中位數(shù)接近0，NUSE中位數(shù)接近1時(shí)，證明樣本數(shù)據(jù)均一性好，質(zhì)量可靠。最后，通過(guò)繪制RNA降解曲線，評(píng)估RNA 5′～3′降解斜率(不宜過(guò)低)，考慮是否剔除降解嚴(yán)重的不可靠樣本。

1.2.2雙因素方差分析 表達(dá)譜芯片經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，導(dǎo)入R語(yǔ)言affy包(http://www.bioconductor.org/)，讀取原始數(shù)據(jù)，利用內(nèi)置rma一體化算法，經(jīng)過(guò)背景校正和歸一化，獲得轉(zhuǎn)化后的特異性探針，即基因表達(dá)水平值。依據(jù)高低骨密度分組，傳統(tǒng)的差異表達(dá)分析僅僅考慮了遺傳因素對(duì)骨密度的影響。本研究中為了探索吸煙與遺傳因素互作，我們把樣本分為吸煙×高骨密度組、吸煙×低骨密度組、不吸煙×高骨密度組、及不吸煙×低骨密度組共計(jì)4組，采用雙因素(吸煙/不吸煙；高/低骨密度)方差分析挖掘同時(shí)與吸煙及骨密度顯著相關(guān)的易感基因。原始P值采用FDR方法校正。如果同一基因?qū)?yīng)于多個(gè)探針，我們保留P值最小的探針代表相關(guān)基因。FDR<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。區(qū)別于傳統(tǒng)的差異基因表達(dá)分析，本研究旨在探索潛在的受吸煙(環(huán)境)調(diào)控，影響骨質(zhì)疏松癥患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵易感基因，解析潛在的吸煙影響骨質(zhì)疏松癥的分子遺傳學(xué)機(jī)制。因此，本研究采用雙因素方差分析，其中顯著的互作基因(FDR<0.05)即為潛在的與吸煙互作的骨質(zhì)疏松易感基因。

1.2.3通路富集分析 為了分析潛在的關(guān)鍵功能性基因及其參與的重要代謝通路，對(duì)于顯著易感基因(FDR<0.05)，我們利用R軟件，導(dǎo)入clusterProfiler包(http://www.bioconductor.org/)進(jìn)行Disease Ontology(DO)，Rectome和KEGG通路富集分析，尋找潛在的與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)生物代謝通路。采用BH方法校正原始P值。BH<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4基因型芯片質(zhì)量控制 對(duì)于SNP 6.0基因型芯片，樣本基因型信息首先被轉(zhuǎn)換成plink軟件標(biāo)準(zhǔn)輸入格式(http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/plink/)，并利用該軟件進(jìn)行質(zhì)控分析。質(zhì)量控制分為樣本水平和單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)位點(diǎn)水平。其中，基因型檢出率低于95%的樣本被剔除。而最小等位基因頻率低于5%，或不滿足哈迪溫伯格平衡(P<0.001)，或分型成功率低于95%的SNP也被剔除。

1.2.5基因環(huán)境互作分析驗(yàn)證通路富集基因 對(duì)于顯著富集代謝通路(BH<0.05)，進(jìn)一步利用基因環(huán)境互作分析驗(yàn)證潛在功能性基因。具體思路如下：基因型芯片經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，生成新的plink格式文件(ped格式文件記錄基因型信息；map格式文件記錄SNP位點(diǎn)信息)，利用annovar軟件(http://genome.ucsc.edu)對(duì)新map文件中的所有SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因注釋(依據(jù)基因內(nèi)含子，外顯子或UTR區(qū)的SNP)，保留注釋基因?yàn)轱@著富集通路基因的SNP，生成新的plink格式文件，存儲(chǔ)基因型信息。對(duì)于髖部和脊椎骨密度，分別利用R軟件的lm函數(shù)，以年齡、身高、體質(zhì)量、性別為協(xié)變量，進(jìn)行多元回歸分析，校正相關(guān)協(xié)變量對(duì)表型的影響，并以校正后的殘差作為新表型。最后，利用plink軟件進(jìn)行基因環(huán)境互作分析(髖部或脊椎骨密度與吸煙互作)，進(jìn)一步驗(yàn)證潛在的與吸煙互作的骨質(zhì)疏松易感基因。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.6蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 為了進(jìn)一步探索驗(yàn)證基因的潛在調(diào)控模型，我們利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(www.string-db.org/) 對(duì)與吸煙和骨質(zhì)疏松癥顯著互作的基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，并提取被驗(yàn)證基因組成的子網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1雙因素方差分析鑒定骨質(zhì)疏松癥與吸煙互作易感基因利用simpleAffy包直觀顯示質(zhì)控總覽圖，結(jié)果顯示，所有樣本的內(nèi)置質(zhì)控探針actin和GAPDH的3′/5′比值均小于1，此外尺度因子均處于正常范圍內(nèi)，說(shuō)明芯片質(zhì)量良好，無(wú)需剔除特定樣本。不同組別芯片大部分基因表達(dá)水平應(yīng)該比較接近。相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)箱線圖(RLE)顯示所有樣本整體表達(dá)水平趨于一致(比值接近1，對(duì)數(shù)值接近0)，符合預(yù)期。此外，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(芯片基因標(biāo)準(zhǔn)差相對(duì)于全體標(biāo)準(zhǔn)差)箱線圖(NUSE)顯示所有樣本基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)差趨于一致(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差接近于1)，表明芯片質(zhì)量較好。RNA降解曲線分析顯示所有樣本5′端熒光強(qiáng)度均低于3′端，符合RNA一般從5′端到3′端降解的理論預(yù)期，降解曲線斜率均較小，說(shuō)明沒有降解嚴(yán)重的樣本出現(xiàn)，進(jìn)一步證明了芯片質(zhì)量良好。

對(duì)于Affymetrix HG-U133A表達(dá)譜芯片，采用rma算法歸一化處理后，總共獲得19 916個(gè)探針的表達(dá)值，對(duì)應(yīng)于12 747個(gè)基因。雙因素方差分析顯示，有4 053個(gè)潛在的與骨質(zhì)疏松癥和吸煙互作相關(guān)聯(lián)的候選易感基因(P<0.05)。如圖1所示，區(qū)別于方差分析方法，單獨(dú)的吸煙或骨密度差異表達(dá)分析僅僅找出2 209個(gè)(54.5%)或657個(gè)(16.2%)重疊基因。如果對(duì)吸煙或骨密度單獨(dú)進(jìn)行差異表達(dá)分析，并取交集，結(jié)果顯示更明顯差異(9.0%重疊率)。這證明了雙因素方差分析方法結(jié)果的特異性。經(jīng)過(guò)FDR校正后，共有441個(gè)顯著關(guān)聯(lián)易感基因(FDR<0.05)。聚類分析顯示，單獨(dú)的吸煙或骨密度分組無(wú)法顯示聚類易感基因，進(jìn)一步驗(yàn)證這441個(gè)基因和吸煙及骨密度均存在顯著關(guān)聯(lián)(圖2)。

2.2通路富集分析對(duì)顯著關(guān)聯(lián)的441個(gè)易感基因進(jìn)行DO和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示僅有間隙連接(gap junction)通路顯著富集(BH校正，P<0.01，表2)。間隙連接通路中12個(gè)富集基因?yàn)椋篍GFR、GJD2、GNAI3、CSNK1D、ADCY9、GNA11、TUBAL3、MAPK7、LPAR1、PRKG1、TUBA1B、TUBA1C。這12個(gè)基因中有4個(gè)基因同時(shí)也參與了其他分子通路調(diào)節(jié)：ADCY9基因還參與了嘌呤代謝通路(purine metabolism)和促性腺激素釋放激素信號(hào)通路(GnRH signaling pathway)；EGFR還參與了促性腺激素釋放激素信號(hào)通路(GnRH signaling pathway)和粘附連接通路(adherens junction)；GNA11和MAPK7還參與了促性腺激素釋放激素信號(hào)通路(GnRH signaling pathway)。這提示4個(gè)基因具有廣泛的分子調(diào)節(jié)功能，可能在疾病發(fā)生與發(fā)展中起關(guān)鍵作用。此外，通路分析顯示大量基因參與了骨相關(guān)的代謝通路(表2)，其中包括經(jīng)典的MAPK通路(10個(gè)基因)，Wnt信號(hào)通路(5個(gè)基因)，成骨細(xì)胞分化通路(4個(gè)基因)，骨疾病(30個(gè)基因)，骨炎癥疾病(29個(gè)基因)，骨重塑疾病(5個(gè)基因)，骨吸收疾病(3個(gè)基因)，骨關(guān)節(jié)炎(6個(gè)基因)，骨質(zhì)疏松(3個(gè)基因)，骨硬化病(3個(gè)基因)。

圖1 雙因素方差分析與傳統(tǒng)分析方法的結(jié)果比較Fig.1 Comparison between two-way ANOVA analysis and traditional analysis

2.3基因環(huán)境互作分析驗(yàn)證通路基因根據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，26個(gè)不滿足檢出率大于95%的樣本(整體檢出率為98.8%)被剔除，41 905個(gè)分型成功率小于95%，203 991個(gè)最小等位基因頻率小于5%，以及3 564個(gè)不滿足哈迪溫伯格平衡(hwe>0.001)，共計(jì)204 973個(gè)SNP被剔除。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后，GWAS數(shù)據(jù)包含1 209名女性，659 180個(gè)SNPs探針數(shù)據(jù)。

利用Annovar軟件對(duì)659 180個(gè)SNP進(jìn)行基因注釋，發(fā)現(xiàn)其中6 360個(gè)SNP定位于外顯子，5 903個(gè)SNP定位于UTR區(qū)，259 913個(gè)SNP定位于內(nèi)含子區(qū)(30個(gè)可能影響可變剪切)?？傆?jì)272 176個(gè)SNP能被注釋到16 623個(gè)基因。我們對(duì)顯著富集的通路(間隙鏈接)及骨相關(guān)通路(表2)的所有基因進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)共有1 027個(gè)SNP(其中1 008個(gè)SNP位于內(nèi)含子，7個(gè)位于外顯子，12個(gè)位于UTR區(qū))能被注釋到37個(gè)基因。此外，有25個(gè)SNP注釋到20個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)。啟動(dòng)子變異對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮重要作用。

圖2 441個(gè)易感基因表達(dá)熱圖Fig.2 Heat map of 441 susceptibility genes

表2 顯著富集或骨相關(guān)代謝通路富集分析結(jié)果Tab.2 Results of bone metabolism functional enrichment analysis

對(duì)表型(髖部骨密度、脊椎骨密度)進(jìn)行協(xié)變量(年齡、性別、身高、體質(zhì)量)校正后，我們分別對(duì)髖部和脊椎骨密度進(jìn)行基因環(huán)境(吸煙×骨密度)互作分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在髖部和脊椎骨密度上分別有10個(gè)和11個(gè)SNP顯著差異(P<0.05)，對(duì)應(yīng)于10個(gè)基因和11個(gè)基因(表3)。兩種表型中均能被驗(yàn)證的為DDR2、ITGA9、EGFR、MSR1、IL7、PRKG1、ADCY9共7個(gè) 基因，其中EGFR、CFTR、LRP6基因均參與了多種重要代謝通路(表2)，表明這3個(gè)基因具有重要的生物功能。

2.4蛋白網(wǎng)絡(luò)分析我們首先分析了14個(gè)驗(yàn)證基因潛在的功能。如圖3A所示，通路分析顯示有8個(gè)潛在基因與骨疾病相關(guān) (BTNL2、CFTR、DDR2、HGD、IL7、ITGA9、LRP6、MSR1)，5個(gè)基因與免疫相關(guān) (PRKG1、EGFR、IL7、PRKG1、ADCY9)，2個(gè)基因參與了骨代謝的經(jīng)典通路：Wnt信號(hào)通路 (WNT16、LRP6)，5個(gè)基因參與了炎癥感染相關(guān)通路(ADCY9、WNT16、SRF、EGFR、ITGA9)。我們進(jìn)一步對(duì)上述14個(gè)驗(yàn)證基因進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除BTNL2基因作用比較孤立外，其他13個(gè)差異基因間存在顯著互作，構(gòu)成1個(gè)復(fù)雜的調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)(圖3B)。這提示EGFR、PRKG1、CFTR、LRP6和ADCY9等13個(gè)基因可能發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)調(diào)控功能，其參與的調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)可能受吸煙因素影響，進(jìn)而對(duì)骨質(zhì)疏松癥相關(guān)代謝發(fā)揮重要調(diào)控作用。

3 討 論

傳統(tǒng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)多聚焦于探索單一因素對(duì)疾病的影響(如基因表達(dá)影響疾病)。然而越來(lái)越多的研究表明環(huán)境因素對(duì)復(fù)雜代謝類疾病，如骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、肥胖等發(fā)揮著重要作用。近期的一篇Science文章報(bào)道人類癌癥66%由環(huán)境決定，徹底顛覆了人們的常規(guī)認(rèn)識(shí)[13]。復(fù)雜疾病的發(fā)生受多基因與環(huán)境互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。近年來(lái),大量研究發(fā)現(xiàn),吸煙與肺癌、冠心病、心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。2017年《Circulation》雜志上的一篇文章發(fā)現(xiàn)了位于ADAMTS7基因上游的rs7178051突變與吸煙間的互作關(guān)系[15]。研究指出，rs7178051(T)會(huì)引起ADAMTS7基因表達(dá)下降，從而降低冠心病風(fēng)險(xiǎn)。在rs7178051(T)人群中，不吸煙者比吸煙者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)降低約12%，并且發(fā)現(xiàn)香煙提取物會(huì)誘導(dǎo)ADAMTS7的表達(dá)，從而增加冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)。目前尚未有吸煙與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息相關(guān)分析，鑒定了骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因與吸煙的互作關(guān)系。

表3 基因環(huán)境互作分析驗(yàn)證互作(吸煙、骨密度)基因(脊椎及髖部骨密度)Tab.3 Validation of smoking-BMD interaction genes by gene-environment interaction analysis (Spine & hip BMD)

圖3 基因環(huán)境互作分析驗(yàn)證基因相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Regulatory network for genes verified by gene-environment interaction analysis

為了確保本研究結(jié)果的可靠性，我們前期采用嚴(yán)苛的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)芯片的多種質(zhì)量評(píng)估結(jié)果均很好地符合預(yù)期，證明了表達(dá)譜芯片質(zhì)量的可靠性。對(duì)于SNP6.0基因型芯片，我們也運(yùn)用了標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控流程。為了剔除相關(guān)因素對(duì)表型的影響，我們進(jìn)一步校正了年齡、BMI等協(xié)變量的影響，保證了分析結(jié)果的可靠性。為了挖掘吸煙與骨質(zhì)疏松互作基因，本研究采用了雙因素方差分析。分析結(jié)果顯著異于傳統(tǒng)差異表達(dá)分析，挖掘出大量新的潛在易感基因，表明了該分析方法的創(chuàng)新性和有效性。

本研究提示了多個(gè)可能與吸煙及骨質(zhì)疏松癥互作密切相關(guān)的核心功能性基因。通路富集分析及蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析均顯示，這些基因間存在顯著互作，且EGFR、LRP6、CFTR等同時(shí)富集在多個(gè)通路中，表明這些基因可能具有廣泛的生物學(xué)調(diào)控功能，從而影響骨質(zhì)疏松相關(guān)代謝過(guò)程。

不同細(xì)胞間可以通過(guò)由縫隙連接蛋白(connexin)組成的離子通道進(jìn)行物質(zhì)交換和通訊，該過(guò)程被稱為Gap junction通路。Gap junction通路具有調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、代謝運(yùn)輸、細(xì)胞凋亡、組織穩(wěn)定等重要功能[17]。已有研究表明Gap junction通路對(duì)于成骨細(xì)胞分化，維持正常骨發(fā)育是必須的。抑制該通路，能促進(jìn)成骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，從而可能打破骨平衡[18]。骨骼穩(wěn)態(tài)及成骨細(xì)胞分化能力伴隨年齡增大而顯著下降，研究表明，Gap junction形成能力與年齡呈負(fù)相關(guān)，這可能部分解釋了為什么老年人骨質(zhì)疏松癥頻發(fā)的現(xiàn)象[19]。Gap junction通路已被證實(shí)和癌癥相關(guān)，早期研究認(rèn)為該通路發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，而近期的研究表明該通路也會(huì)促進(jìn)部分腫瘤惡化[20]。本研究結(jié)果顯示Gap junction可能與骨質(zhì)疏松癥及吸煙相關(guān)。吸煙增加多種癌癥風(fēng)險(xiǎn)已被廣泛證實(shí)，本研究提示Gap juncton通路可能是一個(gè)潛在的癌癥和骨質(zhì)疏松癥共有分子通路，這對(duì)于吸煙人群骨質(zhì)疏松癥患者的藥物選擇或骨肉瘤的藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義。

通路富集分析結(jié)果顯示，CFTR(編碼氯離子通道囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子)富集在多個(gè)骨疾病相關(guān)的代謝通路中。另有研究顯示，該基因突變會(huì)導(dǎo)致囊性纖維化(CF)[21-22]，而CF會(huì)影響許多器官(例如肺和胰腺)，通常也會(huì)導(dǎo)致骨密度(BMD)降低，增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)[23]。一些研究表明，成骨細(xì)胞中CFTR活性的喪失降低了骨保護(hù)素(OPG)的分泌，導(dǎo)致炎癥驅(qū)動(dòng)的骨吸收加重[24]。此外，科學(xué)家在呼吸道相關(guān)疾病研究中發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧在體外和體內(nèi)都會(huì)降低CFTR活性[25-26]。由此推知，吸煙通過(guò)降低人體內(nèi)的CFTR活性，從而影響OPG的分泌，導(dǎo)致BMD降低。因此，通過(guò)吸煙可能與CFTR基因互作，從而引起骨折及骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。然而，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。已有大量研究表明，Wnt通路對(duì)于骨骼發(fā)育和維持至關(guān)重要。我們的研究提示，LRP6(脂蛋白受體相關(guān)蛋白6)及WNT16(人類基因組的19個(gè)WNT配體之一)基因可能是2個(gè)Wnt通路的核心基因，參與了吸煙介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程。已有多項(xiàng)研究指出，LRP6及WNT16基因均會(huì)影響骨質(zhì)疏松癥[27-28]。MANI等[29]發(fā)現(xiàn)，LRP6基因突變的個(gè)體會(huì)引起骨質(zhì)疏松癥等復(fù)雜疾病的發(fā)生。LRP6 rs1181334多態(tài)性與墨西哥絕經(jīng)后婦女髖部BMD的降低有關(guān)[30]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，LRP6控制小鼠的成骨細(xì)胞分化[31-32]。同樣，全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，WNT16基因上的兩個(gè)錯(cuò)義多態(tài)性與80歲以下個(gè)體的BMD及髖部骨折相關(guān)[33]。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是與肺癌密切相關(guān)的明星基因，EGFR突變與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生高度相關(guān)[34-35]。2015年，F(xiàn)AN等[36]研究表明，EGFR是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能的必要分子，上皮調(diào)節(jié)蛋白(一種新的EGFR配體)能夠通過(guò)EGFR-AKT-mTOR信號(hào)通路調(diào)控體外成骨細(xì)胞功能。這說(shuō)明EGFR不但與肺癌的發(fā)生相關(guān)，還參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能。JAFARI等[37]研究表明siRNA介導(dǎo)的PRKG1功能(siPRKG1)喪失能夠促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)向成骨細(xì)胞(OB)分化，這說(shuō)明PRKG1對(duì)成骨細(xì)胞分化和骨形成發(fā)揮抑制作用。他們進(jìn)一步研究表明，在骨缺損位點(diǎn)植入hMSC中的PRKG1的藥理學(xué)抑制劑可以增強(qiáng)骨再生[38]。健康成人BMD的表型變化受遺傳和環(huán)境因素的共同影響。雖然目前缺乏ADCY9基因影響骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)報(bào)道，但有研究證明，ADCY10基因(可溶性腺苷酸環(huán)化酶)的序列變異與高鈣尿癥患者的低脊柱BMD相關(guān)，ICHIKAWA等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)前白人婦女中，ADCY10多態(tài)性與脊髓面積BMD之間有相關(guān)性。

本研究基于大數(shù)據(jù)挖掘，從基因環(huán)境互作分析的新角度，鑒定出了一個(gè)可能與吸煙及骨質(zhì)疏松癥互作相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵分子通路及多個(gè)核心功能性基因。研究結(jié)果對(duì)于骨質(zhì)疏松癥致病機(jī)制認(rèn)識(shí)及相關(guān)藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)均具有重要指導(dǎo)意義。

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