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四逆酸棗仁湯合方對失眠大鼠海馬GABAARα1、γ2及NKCC1的影響

2018-06-25 02:41林炳岐馬捷劉燕于雪范盎然張煒悅戴寧張蔚劉夢溫佳雨李峰北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)診斷系北京100029
中醫(yī)藥學(xué)報 2018年3期
關(guān)鍵詞:酸棗仁海馬西藥

林炳岐,馬捷,劉燕,于雪,范盎然,張煒悅,戴寧,張蔚,劉夢,溫佳雨,李峰(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院-中醫(yī)診斷系,北京 100029)

失眠癥是臨床常見疾病,失眠癥是以頻繁且持續(xù)的入睡困難或睡眠維持困難,并導(dǎo)致睡眠滿意度不足為特征的睡眠障礙[1]。由于現(xiàn)代社會的特點(diǎn),人們的工作壓力增大,生活節(jié)奏加快,導(dǎo)致睡眠不規(guī)律,失眠的人數(shù)呈不斷的上升趨勢,尤其腦力勞動者最為嚴(yán)重。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致失眠的病因很多,但是由于現(xiàn)代社會人們心理負(fù)擔(dān)的加重,情志因素已經(jīng)成為失眠的主要原因[2]。同時,在臨床的實(shí)踐和文獻(xiàn)分析中,很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)失眠的病位在心,但是和肝臟的影響密切相關(guān)[3]。人的正常睡眠和海馬中的γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)能神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān),它是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),能夠抑制神經(jīng)系統(tǒng),具有保護(hù)神經(jīng)的作用,能夠起到催眠、鎮(zhèn)靜和抗焦慮等功能[4]。GABA所起到的神經(jīng)保護(hù)作用是通過結(jié)合其A受體來完成的,A受體中以GABAARα1和GABAARγ2型受體最多,也是GABAA受體重要的功能基團(tuán)。這些受體都含有配體門控氯離子通道蛋白,在Na+-K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NKCC1)的作用下,使Cl-快速內(nèi)流,聚集于神經(jīng)元內(nèi),當(dāng)GABAA受體被激活時產(chǎn)生神經(jīng)元的抑制保護(hù)作用。四逆散和酸棗仁湯是從肝論治失眠的經(jīng)典方劑,具有疏肝解郁、養(yǎng)血安神的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察四逆酸棗仁湯合方對失眠大鼠GABA能傳導(dǎo)系統(tǒng)中GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1的影響,探討四逆酸棗仁湯合方在GABA能傳導(dǎo)系統(tǒng)中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究選用清潔級SD健康雄性大鼠90只,體質(zhì)量180~200 g。動物購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證編號為SCXX(京)2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房,40 W日光燈照射,光照節(jié)律為12 h(06:00—18:00);室內(nèi)溫度為(23±1)℃,相對濕度為30%~40%;正常大鼠飼料喂養(yǎng),自由飲水。

1.2 藥物

四逆散:柴胡6 g,白芍6 g,枳實(shí)6 g,炙甘草6 g;酸棗仁湯:酸棗仁15 g,川芎9 g,知母9 g,茯苓9 g,炙甘草3 g;四逆酸棗仁湯合方:酸棗仁15 g,川芎9 g,知母9 g,茯苓9 g,炙甘草9 g,柴胡6 g,白芍6 g,枳實(shí)6 g。以上生藥均由北京同仁堂醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供,并由北京創(chuàng)立有限責(zé)任公司加工成浸膏備用,出膏率分別為:18.3%、17.6%、18.1%,4℃保存。艾司唑侖:1盒,常溫保存,備用,購自中日友好醫(yī)院。

1.3 主要試劑和儀器

對氯苯丙氨酸(PCPA)(Sigma,美國);戊巴比妥鈉(Sigma,美國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶生物科技有限公司);兔抗GAPDH(Protein tech,美國),兔抗GABAARα1(Protein tech,美國),兔抗GABAARγ2(Protein tech,美國),NKCC1(Protein tech,美國),兔二抗(中山金橋);Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo,美國),PCR Master Mix(Thermo,美國),PCR引物合成(上海生工公司);酶標(biāo)儀Multiskan GO(Thermo,美國);電泳槽(Bio-RAD,美國),電轉(zhuǎn)槽(Bio-RAD,美國);Alpha Innotech凝膠成像儀(FLUORCHEM,美國);CFX96 PCR檢測儀(Bio-RAD,美國),PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD,美國),Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems,美國)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 失眠模型復(fù)制

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天,自由進(jìn)食、進(jìn)水,保持墊料干燥,7 d后稱體質(zhì)量編號,隨機(jī)分為正常組(15只)和造模組(75只),造模組腹腔注射PCPA混懸液[5-6]。PCPA用量按400 mg/10 mL/kg,用弱堿性生理鹽水配置成混懸液備用,正常組腹腔注射等體積的弱堿性生理鹽水,于每日8:00—8:30進(jìn)行,兩組連續(xù)注射2 d。第1次腹腔注射36 h后,造模組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律缺失,白天與夜晚活動不斷,易激惹,整體觀察和正常組不同,提示造模成功。將復(fù)制成功的模型大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、四逆散組、酸棗仁湯組、合方組,并設(shè)置空白對照正常組。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組和給藥

正常組:連續(xù)7 d生理鹽水灌胃;失眠模型復(fù)制成功的大鼠75只,按隨機(jī)數(shù)字表法分成以下5組,每組15只。模型組:連續(xù)7 d生理鹽水灌胃;西藥組:連續(xù)7 d艾司唑侖灌胃;四逆散組:連續(xù)7 d四逆散浸膏灌胃;酸棗仁湯組:連續(xù)7 d酸棗仁湯浸膏灌胃;四逆酸棗仁湯合方組(以下簡稱:合方組):連續(xù)7 d四逆酸棗仁湯合方浸膏灌胃。各用藥組根據(jù)中藥浸膏的出膏率和大鼠給藥體表面積公式計(jì)算出各組大鼠給藥量。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一般狀態(tài)

觀察大鼠的活動狀態(tài)、精神狀態(tài)、皮毛顏色、進(jìn)食量、飲水量和對外界刺激的反應(yīng)等。

2.3.2 體質(zhì)量變化

記錄各組大鼠的每天體質(zhì)量,觀察各組大鼠每天體質(zhì)量的變化。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 取材

給藥結(jié)束后第2天,大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,腹主動脈取血、斷頭,冰上快速剝離大鼠海馬,置于液氮中快速冷凍,再轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱冷凍保存待測,每組隨機(jī)選取5只海馬進(jìn)行RCR檢測,隨機(jī)選取6只海馬進(jìn)行Western Blot檢測。

2.4.2 實(shí)時熒光定量PCR

用Trizol破碎各組大鼠海馬腦組織,離心取上清,依次加入氯仿、異丙醇等提取總RNA;根據(jù)總RNA濃度和反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件為:退火25 ℃,5 min,延伸42 ℃,60 min,失活79 ℃,5 min;GABAARα1mRNA上游引物:5′-AGCTATACCCCTAACTTAGCCAGG-3′,下游引物:5′-AGAAAGCGATTCTCAGTGCAGAGG-3′;GABAARγ2mRNA上游引物:5′-CTTCTTCGGATGTTTTCCTTCAGG-3′,下游引物:5′-CATAGGGTATTAGATCGTTGGACT-3′;NKCC1mRNA:上游引物:5′-TTACTACCTGCGCACCTTCG-3′,下游引物:5′-TCCAGCTCATCGTGGAACTC-3′;β-actin上游引物:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游引物:5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s~60 ℃ 30 s擴(kuò)增40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,讀取PCR軟件內(nèi)循環(huán)閾值(CT值),采用ΔΔCT法處理結(jié)果,以β-actin 為內(nèi)參,計(jì)算GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1的相對表達(dá)量,以2-ΔΔCT表示。

2.4.3 Western Blot

用ripa裂解液提取大鼠海馬腦組織蛋白,采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度,根據(jù)總蛋白濃度配平,使各樣本蛋白等量,取40 μg蛋白樣品,電泳分離,再電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,0.5%的脫脂奶粉封閉1h后,分別加入一抗GABAARα(1∶2 000)、GABAARγ2(1∶2 000)、NKCC1(1∶2 000),GAPDH(1∶50 000),4 ℃孵育過夜,經(jīng)TBST洗膜后加入二抗,室溫孵育1 h,經(jīng)TBST洗膜后加入ECL試劑盒A、B混合液(1∶1),然后曝光、顯影、定影,掃描膠片,用軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察

正常組的大鼠精神狀態(tài)良好,活動靈敏,毛發(fā)有光澤,體質(zhì)量明顯增加。模型組的大鼠精神亢奮,易激惹,毛發(fā)干枯、無光澤,飲水量明顯增加,消瘦。西藥組和各中藥組的大鼠精神狀態(tài)、活動情況與模型組相比有所改觀。

3.2 體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組大鼠體質(zhì)量增量有非常顯著性差異(P<0.01),和正常組相比,模型組體質(zhì)量增量非常顯著性降低(P<0.01);和模型組相比,西藥組、酸棗仁湯組、合方組非常顯著性升高(P<0.01);和西藥組相比,酸棗仁湯組、合方組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明酸棗仁湯組、合方組均可增加大鼠的體質(zhì)量,見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量增量變化

注:與正常組相比,##P<0.01;與模型組相比,**P<0.01

3.3 失眠大鼠海馬腦組織中GABAARα1mRNA、GABAARγ2 mRNA和NKCC1 mRNA的表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示:各組大鼠GABAARα1mRNA的表達(dá)有顯著性差異(P<0.05),和正常組相比,模型組表達(dá)顯著性下降(P<0.05);和模型組相比,西藥組、酸棗仁湯組表達(dá)顯著性上升(P<0.05),合方組GABAARα1mRNA表達(dá)非常顯著性上升(P<0.01);和西藥組相比,酸棗仁湯組、合方組無顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠GABAARγ2mRNA的表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05),但模型組表達(dá)顯示出明顯降低趨勢,且各用藥組都有提高其表達(dá)的趨勢。各組大鼠NKCC1mRNA的表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05),但模型組表達(dá)顯示出明顯升高趨勢,且各用藥組都有降低其表達(dá)的趨勢,見表2。

表2 大鼠海馬GABAARα1mRNA、GABAARγ2mRNA、NKCC1mRNA表達(dá)變化

注:與正常組相比,#P<0.05;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

3.4 失眠大鼠海馬腦組織中GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1蛋白的表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示:各組大鼠GABAARα1有非常顯著性差異(P<0.01),和正常組相比,模型組表達(dá)非常顯著性下降(P<0.01);和模型組相比,西藥組顯著性升高(P<0.05),酸棗仁湯組、合方組非常顯著性升高(P<0.01);和西藥組相比,四逆散組、酸棗仁湯組、合方組無顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠GABAARγ2有非常顯著性差異(P<0.01),和正常組相比,模型組表達(dá)非常顯著性下降(P<0.01);和模型組相比,西藥組、四逆散組顯著性升高(P<0.05),合方組非常顯著性升高(P<0.01);和西藥組相比,四逆散組、酸棗仁湯組、合方組無顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠NKCC1有非常顯著性差異(P<0.01),和正常組相比,模型組表達(dá)非常顯著性上升(P<0.01);和模型組相比,西藥組、四逆散組、酸棗仁湯組、合方組非常顯著性下降(P<0.01);和西藥組相比,四逆散組、合方組無顯著性差異(P>0.05),見表3,電泳圖見圖1。

表3 大鼠海馬GABAARα1、GABAARγ2、NKCC1蛋白的表達(dá)變化

注:與正常組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

4 討論

失眠是臨床上一種常見的疾病,由于現(xiàn)在的時代特點(diǎn)和人們不規(guī)律的生活方式,失眠的人數(shù)也越來越多。有關(guān)失眠的發(fā)生機(jī)制,有兩種比較公認(rèn)的假說,一種是神經(jīng)生物學(xué)層面的“過度覺醒假說”[7],另一種是認(rèn)知行為學(xué)方面的“3P假說”[8-9]。而這兩種機(jī)制的發(fā)生和海馬腦組織中的GABA能神經(jīng)系統(tǒng)有一定的關(guān)系,GABA是腦中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),一直被認(rèn)為和睡眠密切相關(guān),它通過和GABAA受體結(jié)合而發(fā)揮抑制性神經(jīng)保護(hù)作用。GABAA受體是由2個α、2個β和1個γ組成的五聚體大分子[10],在這些受體中, GABAARα1和GABAARγ2是數(shù)量最多的受體,也是反應(yīng)睡眠的最重要的功能基團(tuán),這些受體上的門控氯離子通道蛋白開放導(dǎo)致Cl-內(nèi)流或者外流,從而發(fā)生抑制或者興奮作用。在成熟的神經(jīng)細(xì)胞中,胞膜內(nèi)Cl-的濃度受到NKCC1的影響,若NKCC1表達(dá)量升高時,胞內(nèi)出現(xiàn)高Cl-狀態(tài),當(dāng)GABAA受體被激活,Cl-通道開放,Cl-外流,胞膜去極化,產(chǎn)生神經(jīng)興奮性作用;若NKCC1表達(dá)量下降時,胞內(nèi)出現(xiàn)低Cl-狀態(tài),當(dāng)GABAA受體被激活,Cl-通道開放,Cl-以內(nèi)流,胞膜超極化,產(chǎn)生神經(jīng)抑制性作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)[12],失眠通過不同強(qiáng)度的電針刺激能夠上調(diào)GABAARα1的表達(dá)而起到治療作用。也有研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁-五味子藥對醇水雙提物能夠提高GABAARα1和GABAARγ2的表達(dá)而達(dá)到失眠的治療效果[13]。因此,本實(shí)驗(yàn)選取GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1作為反應(yīng)失眠機(jī)制的觀察指標(biāo)。

圖1 各組大鼠海馬GABAARα1、GABAARγ2、NKCC1蛋白的表達(dá)注:A.正常組;B.模型組;C.西藥組;D.四逆散組;E.酸棗仁湯組;F.合方組

失眠中醫(yī)又稱為“不寐”“不得眠”“臥不安”等,中醫(yī)認(rèn)為失眠的病位在心,但是睡眠的發(fā)生也依賴于肝的正常生理功能,肝主疏泄和藏血功能正常,則人臥魂歸于肝,神志安靜,睡眠安穩(wěn);若由于各種情志因素導(dǎo)致肝的疏泄和藏血功能異常,就會出現(xiàn)失眠,正如《普濟(jì)本事方·獨(dú)活湯》云:“平人肝不受邪,故臥則魂歸于肝,神靜而得寐。今肝有邪,魂不得歸,是以臥則魂揚(yáng)若離體也?!敝委熒衔覀冞x用四逆散和酸棗仁湯合方,二方出自《金匱要略》,是疏肝氣、養(yǎng)肝血的經(jīng)典方劑,二方合用可以恢復(fù)肝的正常生理功能,使睡眠正常。

本次實(shí)驗(yàn)中通過觀察各組大鼠的一般狀態(tài),發(fā)現(xiàn)正常組的大鼠精神狀態(tài)良好,活動靈敏,毛發(fā)有光澤,體質(zhì)量明顯增加。模型組的大鼠精神亢奮,易激惹,毛發(fā)干枯、無光澤,飲水量明顯增加,消瘦。西藥組和各中藥組的大鼠精神狀態(tài)和活動情況和模型組相比有所改善,體質(zhì)量增量也有所增加。

Western Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:失眠大鼠和正常大鼠相比,海馬中GABAARα1和GABAARγ2的表達(dá)明顯降低,經(jīng)過西藥和各中藥治療,西藥、合方能夠有效升高失眠大鼠海馬中GABAARα1和GABAARγ2的表達(dá)量,而四逆散能有效升高大鼠海馬中GABAARγ2表達(dá)量,酸棗仁湯能夠有效升高大鼠海馬中GABAARα1的表達(dá)量。NKCC1的結(jié)果顯示:失眠大鼠和正常大鼠相比,海馬中NKCC1的表達(dá)明顯升高,經(jīng)過西藥和各中藥治療,都能夠有效降低大鼠海馬中NKCC1的表達(dá)量,并且四逆散、合方和西藥治療效果無差異。實(shí)時熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示:失眠大鼠和正常大鼠相比,GABAARα1mRNA表達(dá)明顯下降,西藥、酸棗仁湯、合方能夠有效提高GABAARα1mRNA的表達(dá),酸棗仁湯、合方和西藥效果無差異;各組大鼠海馬中的GABAARγ2mRNA和NKCC1mRNA表達(dá)雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是模型組GABAARγ2mRNA的表達(dá)有明顯下降趨勢,NKCC1mRNA表達(dá)有明顯上升趨勢,且各用藥組都有升高GABAARγ2mRNA、降低NKCC1mRNA表達(dá)的趨勢。兩種實(shí)驗(yàn)說明,失眠大鼠海馬中GABAARα1和GABAARγ2的蛋白和mRNA表達(dá)都降低,而NKCC1的蛋白和mRNA升高,經(jīng)過藥物治療,西藥和各組中藥能夠有效地升高GABAARα1和GABAARγ2蛋白和mRNA的表達(dá),同時降低NKCC1蛋白和mRNA的表達(dá),從而起到治療作用,并且合方組治療效果更全面。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)觀察到,四逆酸棗仁湯合方能夠有效地改善失眠大鼠的睡眠節(jié)律,并且可能是通過上調(diào)大鼠海馬中GABAARα1和GABAARγ2,降低NKCC1而發(fā)揮治療作用。

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