李春燕，張學(xué)敏，岳璐，閆福林*(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453002)

檳榔為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL. 的干燥成熟種子，廣泛栽培于中國(guó)、印度、印度尼西亞、斯里蘭卡、菲律賓等南亞及東南亞國(guó)家[1]。中醫(yī)認(rèn)為檳榔性溫，味辛、苦，歸胃、大腸經(jīng)，具有驅(qū)蟲(chóng)消積、行氣利水、截瘧的功效，檳榔堿是檳榔中的主要活性成分，其他生物堿還有檳榔次堿、去甲基檳榔次堿等[1-3]。

目前測(cè)定檳榔堿含量的方法主要有HPLC、薄層掃描法、毛細(xì)管電泳法和酸堿滴定法等[2,4-6]，而對(duì)檳榔次堿的含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文建立了采用反相高效液相色譜測(cè)定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的分析方法，該方法簡(jiǎn)便易行，靈敏可靠，可用于測(cè)定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的含量 。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；電子天平(萬(wàn)分之一，MS204S型，瑞士Mettler Toledo公司)；電子天平(十萬(wàn)分之一，萬(wàn)分之一，XS205型，瑞士Mettler Toledo公司)；微量高速離心機(jī)(TG-16W型，長(zhǎng)沙湘儀)；上海雷磁公司pH-25型pH計(jì)；德國(guó)MN Nucleosil SA陽(yáng)離子交換色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 試藥

氫溴酸檳榔堿(供含量測(cè)定用)，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；鹽酸檳榔次堿(供含量測(cè)定用)，購(gòu)于SIGMA公司；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Nucleosil SA陽(yáng)離子交換色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.3, 氨試液調(diào)pH3.8)，檢測(cè)波長(zhǎng)：212 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別取檳榔堿和檳榔次堿對(duì)照品適量，精密稱定，加40%甲醇溶解并制成每1 mL約0.5 mg的溶液，作對(duì)照品儲(chǔ)備液，在-20℃下保存?zhèn)溆谩７謩e精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加40%甲醇制成每1 mL中含檳榔堿8 μg和檳榔次堿3 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末約3 g，置于50 mL錐形瓶中，精密加入0.001 mol·L-1磷酸溶液30 mL，回流30 min，濾過(guò)，取1 mL濾液加入1 mL 85%磷酸，用0.45 μm濾器濾過(guò)，收集濾液，取1 mL濾液于10 mL容量瓶中加入40%甲醇溶液稀釋，加入25%氨水500 μL，40%甲醇定容，搖勻，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1，表明其他組分對(duì)檳榔堿和檳榔次堿測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 HPLC色譜圖注：A.對(duì)照品,B.供試樣品；a.檳榔次堿，b.檳榔堿

2.3.2 線性關(guān)系

取檳榔堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，分別精密量取0.4，0.8，1.6，2.4，4.8 mL，置100 mL棕色量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程為Y=0.049 5X+1.388 1，R2=0.999 5(n=5)，結(jié)果表明，檳榔堿在2.02～32.30 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈很好的線性關(guān)系。

取檳榔次堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，分別精密量取0.2，0.4，0.8，1.6，2.4 mL，置100 mL棕色量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程為Y=0.045 1X+0.128 3，R2=0.999 3(n=5)，結(jié)果表明，檳榔次堿在0.85～13.55 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈很好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成每1 mL中約含檳榔堿8 μg和檳榔次堿3 μg的對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，檳榔堿和檳榔次堿峰面積的RSD依次為0.48%和0.67%，結(jié)果表明，本法進(jìn)樣的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，按“3.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，依次進(jìn)樣，6份供試品中檳榔堿和檳榔次堿峰含量的RSD為2.79%和3.01%。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液和供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，分別進(jìn)樣，檳榔堿和檳榔次堿峰對(duì)照品溶液峰面積的RSD為1.87%和2.31%，供試品溶液中檳榔堿和檳榔次堿峰峰面積的RSD為2.18%和2.74%，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，滿足測(cè)定要求。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn)

精密量取檳榔堿和檳榔次堿對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加40%甲醇定量稀釋制成每1 mL中約含檳榔堿100 μg和檳榔次堿50 μg的工作溶液。取已測(cè)得含量的供試品溶液9份，精密稱定，精密加入0.5，1.0，1.5 mL上述工作溶液，按照含量測(cè)定法測(cè)定。檳榔堿的平均回收率為97.2%，RSD為2.4%(n=9)；檳榔次堿的平均回收率為103.9%，RSD為2.6%(n=9)。

2.4 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的10批樣品，照上述測(cè)定方法和色譜條件依法測(cè)定，樣品中檳榔堿和檳榔次堿含量測(cè)定結(jié)果如表1。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的篩選

參照相關(guān)文獻(xiàn)[4,6]，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為412 nm。分別比較了不同色譜柱Diamonsil C18色譜柱和Nucleosil SA陽(yáng)離子交換色譜柱，并考察了流動(dòng)相配比以及柱溫為30℃、35℃和40℃時(shí)的分離情況，在滿足檳榔堿和檳榔次堿與雜質(zhì)峰基線分離的前提下，并使待測(cè)物質(zhì)色譜峰峰形良好的情況下，最好選擇色譜條件為色譜柱為Nucleosil SA陽(yáng)離子交換色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.3, 氨試液調(diào)pH3.8)，檢測(cè)波長(zhǎng)：212 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30℃。

表1 樣品中檳榔堿和檳榔次堿含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3.2 樣品前處理方法的篩選

分別比較了不同溶劑體系：(1)甲醇，(2)40%甲醇，(3)20%甲醇，以及回流時(shí)間20 min、30 min和60 min，結(jié)果表明采用回流30 min的提取效果良好，可以用于本方法體系的含量測(cè)定。

3.3 檳榔產(chǎn)地分析

本文所分析的10批檳榔樣品中，檳榔堿含量均高于0.20%，符合2015版中國(guó)藥典檳榔項(xiàng)下的要求，其中除安徽產(chǎn)的檳榔中檳榔堿含量稍低外，其他產(chǎn)地的檳榔中檳榔堿的含量無(wú)顯著性差異。由于檳榔次堿也是檳榔中的重要活性成分之一，本方法同時(shí)測(cè)定了檳榔次堿的含量，在10批檳榔樣品中檳榔次堿的含量均高于0.05%，故建議藥典中應(yīng)列入檳榔次堿的含量測(cè)定項(xiàng)或相關(guān)質(zhì)量控制項(xiàng)，已便更好的控制檳榔質(zhì)量。

綜上所述，本文所建方法重復(fù)性好，回收率高，能準(zhǔn)確測(cè)定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的含量，為檳榔質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了參考。

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[2] 付克祥，周軼新.檳榔檢測(cè)技術(shù)的研究與應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備,2015,10(10):13-15.

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