■ 王賀 （惠州市海洋技術(shù)中心，廣東 惠州 516001）

李慶勇（惠州市漁業(yè)研究推廣中心，廣東 惠州 516001）

惠州是水產(chǎn)養(yǎng)殖大市，全市水產(chǎn)養(yǎng)殖面積51萬畝，其中海水養(yǎng)殖12萬畝，淡水養(yǎng)殖39萬畝，羅非魚是目前惠州最主要的淡水魚類養(yǎng)殖品種。近年來，惠州羅非魚細菌性疾病多次爆發(fā)，導致大量羅非魚死亡，嚴重影響了惠州羅非魚產(chǎn)業(yè)乃至整個水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，十分有必要對羅非魚細菌性疾病的病原進行分子生物學鑒定并開展藥敏試驗，弄清惠州地區(qū)羅非魚細菌性疾病的致病原和敏感藥物，為羅非魚細菌性疾病的治療提供參考。與傳統(tǒng)的細菌鑒定相比，細菌的分子生物學鑒定具有快速、準確以及成本低等特點，且已經(jīng)建立了完善的鑒定方法步驟，對市級水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)人員比較適用。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗菌株為2014-2017年在惠州轄區(qū)內(nèi)患病羅非魚體內(nèi)采集保存的菌株，共172株。腦心浸液培養(yǎng)基、血平板等微生物培養(yǎng)試劑耗材全部購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；藥敏片為英國產(chǎn)OXOID品牌；分子鑒定試劑耗材購自大連寶生生物有限公司（TaKaRa）。

1.2 病原鑒定

革蘭氏染色初步判斷。按照DNA提取試劑盒說明書的方法提取細菌DNA作為模板，以1492r/F27為引物，進行PCR擴增（擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸7min）。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，測序結(jié)果在GenBank上進行序列比對，進行16S rRNA的分子鑒定。

1.3 藥敏分析

根據(jù)已報道的文獻選取常用藥物紙片20種（表1）。挑取單克隆菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，使用BioPhotometer plus測定菌液OD600數(shù)值，空白對照為同批次的滅菌BHI液體培養(yǎng)基。根據(jù)測得的OD600數(shù)值計算菌液濃度，然后使用無菌的BHI液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至1.5×108CFU/ml，移液器吸取調(diào)整后的菌液200μL于固體BHI平板，使用滅菌后的L型玻璃棒均勻涂布。待菌液稍晾干之后，使用鑷子貼上藥敏紙片，每個平板放置5～6種藥敏紙片，每一株分離菌株設(shè)置兩個平行實驗組，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)24h。然后用電子游標卡尺，測定抑菌圈大小，參照藥敏紙片產(chǎn)品說明書對菌株的藥物敏感性進行判定（表1）。

2 結(jié)果

2.1 鑒定結(jié)果

表1 藥敏紙片種類及判定標準

鑒定的172株菌株中，革蘭氏陽性菌（G+）153株，占89%；革蘭氏陰性菌（G-）19株，占11%。PCR結(jié)果顯示，擴增的片段在1,500bp處有明顯條帶（圖1）；經(jīng)測序并在GenBank上比對發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌153株，嗜水氣單胞菌8株，遲緩愛德華氏菌3株，維氏氣單胞菌6株，類志賀鄰單胞菌2株。

2.2藥敏分析結(jié)果

藥敏分析結(jié)果顯示，菌種對不同藥物的敏感性不同（圖2），其中無乳鏈球菌主要對卡那霉素、慶大霉素、磺胺復合物、鏈霉素等耐藥，對氧氟沙星、四環(huán)素等敏感（見表2）。嗜水氣單胞菌主要對慶大霉素、磺胺復合物、四環(huán)素等耐藥，對恩諾沙星、強力霉素、氟苯尼考等敏感；維氏氣單胞菌對林可霉素、青霉素G、慶大霉素及氯霉素耐藥，對氧氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考等敏感；遲緩愛德華氏菌對磺胺復合物、四環(huán)素等耐藥，對恩諾沙星、氧氟沙星等敏感。

3 討論

2014～2017年采集保存的172株羅非魚致病菌中，無乳鏈球菌數(shù)量為153株，占總數(shù)的89%，說明近年來導致惠州羅非魚發(fā)生細菌性病的致病原主要為無乳鏈球菌，其他致病菌相對出現(xiàn)較少。但在采樣的過程中也發(fā)現(xiàn)，癥狀相似的患病羅非魚上分離到的致病菌并不屬于同一種菌。如眼球突出通常作為判斷羅非魚鏈球菌病的主要癥狀，但是在眼球突出的患病羅非魚體內(nèi)也分離到過單一的遲緩愛德華氏菌。因此，在日常的技術(shù)服務(wù)過程中，單靠經(jīng)驗或突出癥狀判斷羅非魚病因已經(jīng)不太準確。利用現(xiàn)代分子生物學手段進行病原鑒定是較為準確快捷的一種方法。

表2 羅非魚源無乳鏈球菌分離菌株（153株）對20種藥物的藥敏試驗結(jié)果

圖1 部分菌株16S rRNA 擴增結(jié)果電

圖2 細菌藥敏試驗

在漁業(yè)生產(chǎn)實際活動中，養(yǎng)殖的水產(chǎn)動物一旦發(fā)病，養(yǎng)殖戶最迫切的需要是用藥指導，以減少養(yǎng)殖損失，因此，快速、簡便、科學、合理的用藥指導方法就顯得尤為重要。目前，藥敏分析是較為準確簡便的方法。在實際操作中，為盡快給予準確的用藥指導方案，可不用進行病原鑒定而直接進行藥敏分析，根據(jù)藥敏實驗結(jié)果為養(yǎng)殖戶提供快速的用藥指導意見，能大大縮短時間，最大限度減少養(yǎng)殖戶損失。