周艷輝，劉春苗，楊國帥，余丹，周律，劉炫軍(?？谑腥嗣襻t(yī)院，?？?70208)

癲癇是一種以神經(jīng)元異常放電為主要病理特征的致殘性神經(jīng)系統(tǒng)病變，是發(fā)作性意識喪失的常見原因。其病理機制涉及神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常、神經(jīng)元凋亡、離子通道功能失衡及突觸重塑等多重細胞與分子生物學(xué)行為的異常[1，2]。目前，臨床治療癲癇的主要目標是控制急性發(fā)作癥狀，尚無理想方案改變其神經(jīng)病理，也不能阻止其自然病程，從細胞與分子水平有效抑制其病理進程仍然是未來研究的方向。亞低溫治療腦缺血、腦損傷取得了良好的成效，其腦保護作用機制包括降低腦氧耗與顱內(nèi)壓、提高腦灌注及抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度釋放等。有研究指出，亞低溫治療對改善癲癇有積極作用[3～5]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在神經(jīng)元發(fā)育及突觸重塑中發(fā)揮重要作用，是近年研究癲癇病理機制的熱點。2016年6～12月，本研究探討血管內(nèi)亞低溫治療對腦缺血性癲癇大鼠神經(jīng)元異常放電的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性SD大鼠100只，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自浙江大學(xué)實驗動物中心。雷帕霉素(輝瑞制藥有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；mTOR多克隆兔抗、mTOR phospho S2448多克隆兔抗、S6K1單克隆兔抗、S6K1 phospho T389多克隆兔抗、AKT1多克隆兔抗、AKT1 phospho S473多克隆兔抗(abcam)。S240解剖學(xué)顯微鏡、CH20-BIM光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)；BL310生物機能試驗系統(tǒng)(成都泰盟補充公司全稱)；腦立體定位儀(美國Stoleting公司)；MDF-382EN深低溫冰箱(日本三洋公司)。

1.2 動物分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組共5組，每組20只?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組均采用血管內(nèi)線栓閉塞法制備腦缺血癲癇模型。模型制備方法：大鼠用戊巴比妥腹腔注射麻醉(45 mg/kg)，立體定位儀固定，監(jiān)測腦電圖。取頸部正中切口，依次分離皮膚和皮下組織，顯露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈及其分支。夾閉頸內(nèi)動脈能夠有效阻斷全腦供血，采用線栓法在右側(cè)CCA近分叉處暫時夾閉血管，手術(shù)鉗內(nèi)推至頸內(nèi)動脈，并勒緊。多普勒流量計監(jiān)測皮質(zhì)腦血流量，皮質(zhì)腦血流量下降70%以上，且監(jiān)測到癲癇波(NCS)為造模成功。模型制備成功后，亞低溫組予以亞低溫治療3 h/d；mTOR抑制劑組腹腔注射mTOR抑制劑雷帕霉素0.27 mg/kg，1次/d。均持續(xù)治療3 d。除去死亡大鼠，空白組、假手術(shù)組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組最終剩余大鼠分別為20、18、15、14、16只。

1.3 大鼠神經(jīng)元異常放電頻率檢測 用戊巴比妥麻醉大鼠，立體定位儀固定，使用美國epoch小動物腦電/心電遙測記錄系統(tǒng)測定腦電圖。于頭雙側(cè)額頂部對稱性鉆4個孔至皮層，分別植入4個記錄電極，在跨橫竇竇匯及人字縫處鉆1個孔植入?yún)⒖茧姌O。獲取腦電波并傳輸至多參數(shù)顯示儀，自動記錄NCS出現(xiàn)的頻率與時間，連續(xù)監(jiān)測12 h，神經(jīng)元異常放電頻率=NCS波持續(xù)時間/總時間×100%。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評價 采用Longa的5分制法[6]評價大鼠神經(jīng)行為學(xué)。將神經(jīng)損傷分為0、1、2、3、4分共5個評分等級，0分：大鼠活動正常；1分：前爪屈伸困難；2分：行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走向?qū)?cè)傾倒；4分：完全無法行走。

1.5 大鼠腦梗死率測算 造模后3 d，5組各取6只大鼠，直接斷頭取腦，置于-20 ℃冷凍定型。腦組織冠狀切片，厚度約2 mm，置于1% TTC染液中，37 ℃孵育20 min，被染成灰白色區(qū)域為梗死區(qū)域。采用圖像分析軟件Image Pro Plus分析各切片梗死區(qū)域占比，并計算腦梗死率。

1.6 大鼠海馬組織中mTOR通路相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western blotting法。造模后3 d取5組剩余大鼠進行麻醉，斷頭取腦，分離海馬組織。冰上剝離海馬組織，生理鹽水沖洗干凈血液，置入無菌EP管，-70 ℃勻漿。冰上解凍，電動勻漿機勻漿，用TRIzol法提取海馬總蛋白，溶解于buffer緩沖液，并采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，最終稀釋為1 μg/μL。配置SDS-PAGE凝膠，每個通道上樣10 μL，以40 V電壓預(yù)電泳30 min清除凝膠內(nèi)雜質(zhì)，90 V電壓電泳60～90 min。將電泳后的凝膠條帶轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂牛奶封閉90 min，37 ℃振蕩搖勻。封閉后可即刻進行抗體孵育，以3%的脫脂牛奶溶解抗體，一抗孵育4 ℃過夜；二抗孵育37 ℃ 90 min。ECL顯色液顯色，暗室顯影，保留膠片，用Image J分析灰度值作為目標蛋白相對表達量。計算磷酸化蛋白激酶B(p-AKT1)/AKT1、磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR、磷酸化核糖體蛋白S6激酶1(p-S6K1)/S6K1。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)元異常放電頻率及神經(jīng)行為學(xué)評分比較 空白組、假手術(shù)組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組神經(jīng)元異常放電頻率分別為10.7%±3.4%、11.5%±3.7%、63.2%±6.4%、33.2%±6.7%、35.2%±5.8%?？瞻捉M與假手術(shù)組神經(jīng)元異常放電頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；與空白組、假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)元異常放電頻率高(P均<0.05)；與模型組比較，亞低溫組、mTOR抑制劑組神經(jīng)元異常放電頻率低(P均<0.05)；亞低溫組與mTOR抑制劑組神經(jīng)元異常放電頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 各組神經(jīng)行為學(xué)評分分布比較 模型組神經(jīng)行為學(xué)評分分布與空白組、假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，與亞低溫組、mTOR抑制劑組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評分分布比較(只)

2.3 各組腦梗死率比較 空白組、假手術(shù)組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組腦梗死率分別為11.2%±2.4%、12.3%±2.7%、88.5%±11.4%、50.2%±6.5%、66.1%±7.4%?？瞻捉M與假手術(shù)組腦梗死率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；與空白組、假手術(shù)組比較，模型組腦梗死率高(P均<0.05)；與模型組比較，亞低溫組、mTOR抑制劑組腦梗死率低(P均<0.05)；與亞低溫組比較，mTOR抑制劑組腦梗死率高(P<0.05)。

2.4 各組mTOR通路相關(guān)蛋白表達比較 與空白組、假手術(shù)組比較，模型組p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1高(P均<0.05)；與亞低溫組、mTOR抑制劑組比較，模型組p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組mTOR通路相關(guān)蛋白表達比較

2.5 異常放電頻率與其他指標的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組異常放電頻率與p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1呈正相關(guān)(r分別為0.689、0.884、0.861，P均<0.01)。

3 討論

腦缺血與癲癇雖然是兩種獨立的疾病，卻存在因果關(guān)系。腦缺血是癲癇的常見病因，腦梗死患者的癲癇發(fā)病風險是非腦血管病患者的23倍。兩者有可能存在同樣的病理機制，這也是腦缺血制備癲癇模型的理論依據(jù)[7，8]。腦缺血患者的神經(jīng)細胞同時面臨缺血再灌注損傷、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等一系列病理損傷，線粒體功能障礙妨礙了突觸傳遞而致使癲癇發(fā)生率升高。反之，癲癇的發(fā)生又能夠加重神經(jīng)細胞的損傷。近十幾年，隨著抗癲癇藥物的開發(fā)，癲癇患者的生存質(zhì)量得到了較大提高，但抗癲癇藥的治療目標尚局限于緩解臨床癥狀。另外尚有20%～40%的難治性癲癇患者對抗癲癇藥物不敏感，還需繼續(xù)探索新的抗癲癇方案。亞低溫治療最初應(yīng)用于顱腦損傷和腦梗死的臨床治療[9，10]，后經(jīng)證實也適用于改善癲癇導(dǎo)致的腦損傷[11，12]，但其病理機制尚未明確。本研究以腦缺血的方式制備癲癇模型，觀察血管內(nèi)亞低溫治療對腦缺血性癲癇大鼠模型海馬區(qū)神經(jīng)元異常放電的影響，為完善其作用機制提供數(shù)據(jù)支撐。

本研究整體造模成功率為75.0%，這一數(shù)據(jù)與其他研究[13]的數(shù)據(jù)基本一致。24 h腦電圖是診斷和評估癲癇發(fā)病程度的重要手段之一，利用癲癇的特有放電信號判斷病變狀態(tài)，是臨床診斷與評價癲癇的主要依據(jù)。因此本研究以腦電圖異常放電頻率作為首要考察指標。研究結(jié)果顯示與空白組和假手術(shù)組相比，模型組的異常放電頻率和梗死率高，同時神經(jīng)行為學(xué)評分分布降低；與模型組相比，亞低溫組和mTOR抑制劑組的異常放電頻率和梗死率低，同時神經(jīng)行為學(xué)評分高。該結(jié)果較為直觀地說明亞低溫治療與mTOR抑制劑均能夠較好的抑制腦缺血性癲癇大鼠的神經(jīng)元異常放電。

癲癇的發(fā)病機制極為復(fù)雜，作為調(diào)節(jié)細胞生長和細胞周期進程的信號匯聚點，mTOR信號通路起了關(guān)鍵性作用。神經(jīng)元異常凋亡、突觸重構(gòu)和能量代謝異常均是癲癇的重要病理特征，而這些生物學(xué)行為均離不開mTOR信號通路的參與[14，15]。在紅藻氨酸誘發(fā)的癲癇中觀測到mTOR信號通路的異常激活，且證實雷帕霉素干預(yù)可有效抑制神經(jīng)元異常放電[16]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦缺血誘發(fā)的大鼠癲癇模型中，雷帕霉素同樣有效抑制神經(jīng)元異常放電。進一步數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，神經(jīng)元異常放電頻率與海馬區(qū)P-AKT1/AKT1、P-mTOR/mTOR及P-S6K1/S6K1呈正相關(guān)，說明mTOR信號通路參與了腦缺血性癲癇的發(fā)生發(fā)展。另有研究證實，mTOR信號通路廣泛參與了皮質(zhì)發(fā)育畸形所致癲癇、病毒感染所致癲癇、大腦腫瘤所致癲癇等多種獲得性癲癇模型的病理進程，很有可能既是癲癇發(fā)作的結(jié)果，也是促進癲癇進展的因素[17]。

mTOR屬于PI3K相關(guān)蛋白激酶家族，有mTORC1和mTORC2兩種形式，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，能使底物的Ser/Thr發(fā)生磷酸化[18]。其中PI3K與AKT是mTOR的上游信號，刺激源首先活化PI3K，活化的PI3K促進AKT磷酸化，進而上調(diào)mTORC1表達。S6K1是mTORC1的重要下游信號，磷酸化后可啟動核糖體與蛋白質(zhì)的生物合成[19]，而該過程與突觸形成息息相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在改善腦梗死和抑制神經(jīng)元異常放電方面，亞低溫治療與mTOR抑制劑能取得相仿的效果。為明確亞低溫治療是否對mTOR信號通路有影響，本研究對各組大鼠海馬區(qū)p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1做了測算，結(jié)果顯示與空白組和假手術(shù)組相比，模型組以上比值高；與模型組相比，亞低溫組和mTOR抑制劑組以上比值低?？梢妬喌蜏刂委煂-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1的作用與mTOR抑制劑一致，亞低溫治療也能抑制mTOR通路，從而緩解神經(jīng)元異常放電。

綜上所述，亞低溫治療能夠抑制腦缺血性癲癇大鼠海馬區(qū)mTOR通路，從而緩解神經(jīng)元異常放電。這可能為其治療癲癇的重要機制之一。

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