呂強，李美亭，劉宇，胡云霞(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，成都610072)

在體外循環(huán)、肺栓塞及肺移植中易發(fā)生肺缺血再灌注損傷(LIRI)。缺血再灌注時中性粒細胞在組織損傷處聚集，釋放氧自由基、細胞因子等促炎因子，引起細胞凋亡、壞死和組織損傷，最終導致器官功能不全。在炎癥、器官缺血再灌注損傷等多種應激條件下，環(huán)氧化酶2(COX-2)水平升高。骨骼肌缺血再灌注引起肺損傷時，肺組織中COX-2表達增加，抑制COX-2表達可減少炎性因子生成，減輕肺損傷[1]。帕瑞昔布是臨床常用的特異性COX-2抑制劑。Zhang等[2]發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布通過抑制炎癥及氮化應激反應而減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷。血紅素加氧酶1(HO-1)為誘導型血紅素加氧酶。在細胞應激過程中，HO-1活化是最重要的細胞保護機制之一。帕瑞昔布通過活性氧簇(ROS)依賴途徑誘導巨噬細胞和血管平滑肌細胞表達HO-1[3]。有研究結果顯示，HO-1高表達可減輕LIRI及內(nèi)毒素引起的急性肺損傷[4，5]。HO-1過表達的細胞保護作用與其抗氧化功能、維持微環(huán)境穩(wěn)定、抗細胞凋亡及抗炎性反應有關[6]。2016年8月～2017年10月，本研究擬觀察帕瑞昔布預處理對LIRI大鼠的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級雄性SD大鼠32只，由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供，體質(zhì)量280～300 g。適應性喂養(yǎng)3 d后，將其隨機均分為4組：假手術組(S組)、缺血再灌注組(I組)、帕瑞昔布組(P組)及鋅原卟啉組(Z組)。帕瑞昔布由輝瑞中國有限公司贈與；鋅原卟啉購于美國Sigma公司。小動物呼吸機購于成都泰盟軟件有限公司；電子天平購于上海精密科學儀器有限公司；血氣分析儀(i-STAT1)購于美國雅培公司；熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司；Amersham imager 600多功能成像儀購于美國GE公司。

1.2 LIRI模型制備 實驗前動物均禁食12 h，自由飲水。腹腔注射3.6%水合氯醛1 mL/100 g進行麻醉，取仰臥位固定。于大鼠頸部正中切口，分離氣管，切開氣管并插入氣管內(nèi)導管，固定后連接小動物呼吸機行機械通氣，吸入室內(nèi)空氣，潮氣量8 mL/kg、呼吸頻率80次/min、吸呼比1∶2。經(jīng)右側腹股溝切口分別游離股動、靜脈并置入24G靜脈留置針。將大鼠轉(zhuǎn)為右側臥位，取左側第5肋間逐層開胸，游離左肺門，經(jīng)股靜脈給予肝素100 U/kg。暫停機械通氣后立即用無創(chuàng)血管夾阻斷左肺動脈、左肺靜脈和左主支氣管，用濕紗布覆蓋切口。阻斷60 min后，重新開放左肺門，并適度膨肺使左肺充分復張。繼續(xù)機械通氣120 min后，放血處死大鼠，取腫組織。S組只開胸游離左肺門，但不阻斷；I組開胸游離并阻斷左肺門；P組在阻斷左肺門前15 min經(jīng)股靜脈給予帕瑞昔布10 mg/kg；Z組在缺血前24 h經(jīng)腹腔注射鋅原卟啉20 mg/kg，其余同P組。S組、I組經(jīng)股靜脈注射等體積生理鹽水。

1.3 動脈血氣分析 分別于阻斷左肺門前5 min(T0)、再灌注后120 min(T1)時經(jīng)股動脈采集各組血液，i-STAT1血氣儀檢測血氣分析指標。記錄氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)，并計算氧合指數(shù)(OI)、肺泡動脈血氧分壓差(PA-aO2)。OI=PaO2/吸入氧濃度(FiO2)，PA-aO2=(大氣壓-飽和水蒸氣壓)×FiO2-PaCO2/0.8-PaO2。

1.4 肺組織濕干重比(W/D)測算 再灌注120 min后，取各組左肺上段稱量濕重，隨后置于80 ℃烘箱內(nèi)干燥48 h稱量干重，并計算W/D。

1.5 肺組織病理變化觀察 再灌注結束時，取各組左肺下段浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定3 d，石蠟包埋后切成厚度為10 μm薄片，經(jīng)HE染色后在光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6 肺組織HO-1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR技術。取各組左肺中段肺組織，用TRIzol試劑提取總RNA并取5 μL逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參。β-actin上游引物：5′- GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，下游引物：5′- TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′；HO-1上游引物：5′- CGACAGCATGTCCCAGGATT-3′，下游引物：5′- CATCACCAGCTTAAAGCCTT-3′。RT-PCR反應條件：95 ℃預變性60 s，95 ℃ 15 s，54 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.7 肺組織內(nèi)HO-1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。用蛋白裂解液提取肺組織蛋白質(zhì)并測量總蛋白濃度。每孔上樣量50 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗稀釋液(1∶1 000，武漢三鷹生物技術有限公司)，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST液漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液(1∶10 000)，室溫下孵育1 h，滴加ECL顯影液，Amersham imager 600多功能成像儀曝光后，用Image J圖像分析軟件進行分析，對HO-1蛋白表達豐度進行相對定量分析。

2 結果

2.1 各組大鼠血氣分析指標及肺組織W/D值比較 T0時各組大鼠OI、PA-aO2比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。T1時，與S組比較，I組、P組及Z組中OI低、PA-aO2高(P均<0.05)，且I組、Z組OI、PA-aO2變化更明顯(P均<0.05)。與S組比較，其余三組W/D值高(P均<0.05)，且I組、Z組W/D值較P組高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠OI、PA-aO2及肺組織W/D值比較

2.2 各組肺組織病理變化比較 S組肺泡結構基本正常；I組肺泡破壞較多，肺泡壁明顯增厚，間質(zhì)水腫并伴有大量中性粒細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有水腫液聚集；P組肺泡壁仍比S組增厚，但明顯較I組減輕，且中性粒細胞浸潤較少；Z組肺組織病理改變與I組相似。

2.3 各組肺組織中HO-1表達比較 與S組比較，I組、P組及Z組HO-1 mRNA、蛋白表達高(P均<0.05)，且P組最高(P均<0.05)，I組與Z組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組肺組織中HO-1表達比較

3 討論

肺缺血時激活大量促炎因子、趨化因子和補體系統(tǒng)，使中性粒細胞在肺內(nèi)聚集，導致肺組織損傷；另外，產(chǎn)生的ROS，可引起肺組織氧化損傷和細胞死亡。LIRI后，肺泡毛細血管屏障破壞，肺組織通透性增加，血漿成分滲出增多，引起肺間質(zhì)水腫和出血，導致?lián)Q氣功能障礙。肺組織W/D值可間接反映肺內(nèi)液體滲出程度；OI及PA-aO2可作為判斷肺換氣功能是否正常的指標。本研究結果發(fā)現(xiàn)，LIRI后，肺組織W/D值高，OI低，PA-aO2高；給予帕瑞昔布預處理后，上述指標均有明顯改善，肺組織病理改變也明顯減輕。表明帕瑞昔布可減輕缺血再灌注引起的肺間質(zhì)水腫和組織損傷，改善氧合功能。

在炎癥、缺血再灌注、應激等多種情況下，細胞因子、生長因子及內(nèi)毒素等均可誘導COX-2表達并在組織損傷過程中發(fā)揮作用，因此，阻斷COX-2而具有抗炎特性[7]。研究顯示，在肝臟、腎臟缺血再灌注時，COX-2表達增加，抑制COX-2可減輕器官損傷[8,9]。同樣，在肺缺血再灌注時，肺組織中COX-2表達水平也明顯增加[10]。帕瑞昔布是一種特異性的COX-2抑制劑[11]。Meng等[12]在呼吸機誘導的肺損傷中發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布可明顯減輕局部及全身炎性反應，從而降低肺泡上皮通透性、減輕水腫，增加OI，改善氣體交換；還可減少細胞凋亡。在肝臟缺血再灌注模型中還發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布可顯著抑制炎癥級聯(lián)反應，并降低誘導型一氧化氮合成酶表達，減輕組織損傷[2]。因此，帕瑞昔布可能從多個方面減輕LIRI。

本研究結果顯示，帕瑞昔布預處理可減輕LIRI，并且增加肺內(nèi)HO-1表達；HO-1抑制劑鋅原卟啉則抵消了帕瑞昔布的肺保護作用。HO-1催化游離血紅素降解生成鐵、一氧化碳(CO)和膽綠素，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等特性。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1表達升高可保護肺組織免遭缺血再灌注損傷[13]。HO-1的抗炎作用表現(xiàn)為減少多形核白細胞在肺內(nèi)聚集，并調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的完整性，降低微血管通透性[14]。Kinderlerer等[15]發(fā)現(xiàn)，HO-1也可通過增強血管內(nèi)皮抵抗補體介導的損傷發(fā)揮肺保護作用。此外，HO-1的肺保護作用還可能與其催化代謝產(chǎn)物有關。HO-1和CO均有免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)抗原遞呈細胞、樹突細胞和調(diào)節(jié)性T細胞的功能[16]。HO-1/CO系統(tǒng)還可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)引起的線粒體動態(tài)失衡而減輕肺損傷[17]。CO還可增加抗凋亡蛋白表達，減少Caspase-3活化，激活應激反應轉(zhuǎn)錄因子[18]。同樣，膽綠素也可通過抗氧化、抗炎和抗凋亡作用保護缺血再灌注肺損傷[19]。

一般認為，COX-2抑制劑通過抑制COX-2誘導HO-1表達。然而，在硝普鈉介導的細胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑誘導HO-1表達并不依賴于對COX-2的抑制[20]。同樣，在血管內(nèi)皮細胞中，COX-2抑制劑活化PI3K/AKT途徑和線粒體氧化信號通路增強HO-1介導的抗炎活性；在細胞培養(yǎng)基中加入伊諾前列腺素或前列腺素E2并不能逆轉(zhuǎn)COX-2抑制劑介導的HO-1表達，表明存在環(huán)氧化酶非依賴性途徑誘導HO-1表達[21]。因此，帕瑞昔布誘導缺血再灌注肺組織中HO-1表達的具體機制還需進一步研究。

綜上所述，帕瑞昔布預處理可改善大鼠LIRI后肺氧合功能，減輕肺損傷；增加缺血再灌注肺組織中HO-1表達；抑制HO-1表達則可消除帕瑞昔布的肺保護作用。因此，帕瑞昔布對LIRI的保護作用與HO-1表達升高有關。

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