何紹俊，陳毅斐，楊炯(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢430072)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及分子參與的慢性氣道炎性疾病[1]，其中發(fā)揮作用的細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等，主要表現(xiàn)為細(xì)胞浸潤、氣道高反應(yīng)性、黏液分泌過多、氣道重塑和可逆的氣流受限等。在不同的國家和地區(qū)支氣管哮喘的發(fā)病率為1%～18%。哮喘發(fā)病機制有多種假說，其中最經(jīng)典的是Mosmann等[2]提出的“1型輔助性T細(xì)胞/2型輔助性T細(xì)胞(Th1/Th2)失衡學(xué)說”。該學(xué)說認(rèn)為，哮喘發(fā)病過程中，Th1細(xì)胞功能會受到抑制而Th2細(xì)胞功能出現(xiàn)亢進。Th1細(xì)胞因子γ干擾素(IFN-γ)分泌減少，其抑制哮喘氣道炎癥及黏液分泌的功能受到削弱；與之相反，Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素4(IL-4)、IL-5等分泌增加，刺激肥大細(xì)胞增生并產(chǎn)生IgE，募集嗜酸性粒細(xì)胞，增強血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1的表達，導(dǎo)致氣道慢性持續(xù)炎癥及氣道高反應(yīng)性[3,4]。IL-27是2002年發(fā)現(xiàn)的IL-6/IL-12家族新成員[5]，由EB病毒誘導(dǎo)基因3(EBI3)及p28兩個亞單位組成，主要由活化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)產(chǎn)生[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-27是一種多功能免疫調(diào)節(jié)分子，在多種免疫性疾病中差異調(diào)節(jié)，發(fā)揮促炎或抑炎作用[7]。本研究通過觀察哮喘患者急性發(fā)作期與正常人外周血IL-27水平的差異，為成人哮喘的診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年2～6月本院收治的支氣管哮喘急性發(fā)作期患者20例作為哮喘組，男11例、女9例，年齡(41.71±2.36)歲，F(xiàn)EV1占預(yù)測值百分比(75.40±2.61)%。哮喘組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合支氣管哮喘急性發(fā)作期診斷標(biāo)準(zhǔn)(以下呼吸系統(tǒng)癥狀超過1項：喘息、氣短、胸悶、咳嗽，支氣管舒張試驗陽性)；年齡≥18歲；未合并其他呼吸系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等；近4周內(nèi)未使用激素治療。同期選擇體檢健康者12例作為對照組，男6例、女6例，年齡(38.11±2.43)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)；患者均簽署醫(yī)患溝通知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集 收集兩組外周靜脈血10 mL，肝素鈉抗凝，2 000 r/min離心10 min，分離血清，于-80 ℃保存。剩余血細(xì)胞加入等體積PBS稀釋后，置于淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物公司)上方，2 000 r/min離心20 min，分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，用PBS清洗2次。

1.3 外周血中樹突狀細(xì)胞比例檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取部分PBMC，根據(jù)抗體說明書加入FITC-Lineage Cocktail(美國eBioscience公司)20 μL及PE-HLA-DRA(美國eBioscience公司)5 μL，4 ℃避光放置40 min，對樹突狀細(xì)胞進行標(biāo)記。PBS清洗2次，加入固定液，常溫避光放置30 min，對細(xì)胞膜進行固定。固定完成后，使用破膜劑清洗2次，加入APC-IL-27(美國R&D Systems公司) 10 μL，常溫避光進行胞內(nèi)染色50 min，破膜劑清洗2次后重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測IL-27表達陽性的細(xì)胞即為樹突狀細(xì)胞。

1.4 PBMC中IL-27亞基及Th1、Th2轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR技術(shù)。用TRIzol法抽提PBMC總RNA，試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟參照日本Toyobo公司提供的試劑盒說明書進行操作，均在冰上進行。實時熒光定量PCR步驟參照Takara公司的提供的熒光定量PCR說明書進行操作，操作步驟均在超凈臺中進行。p28上游引物： 5′-GCTGGCTCAGCCTGTTG-3′、下游引物：5′-AGCAGCTTCCTGGCGAGATG-3′，148 bp；EBI3上游引物：5′-TGTTCTCAATGGCTCCCTAC-3′、下游引物：5′- GCTCCCTGACGCTTGTAAC-3′，236 bp；T-bet上游引物：5′-CCAGTTCATTGCCGTGAC-3′、下游引物：5′-ACTTTCCAAATCCCTCCC-3′，114 bp；GATA3上游引物： 5′-ATGGCACGGGACACTACCT-3′、下游引物：5′-TCCCCATTGGCATTCCTC-3′，175 bp；β-actin上游引物：5′-TCGCTCCAACCGACTGCT-3′、下游引物：5′-AATGCTTCTAAGCGGACTATG-3′，194 bp。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、cDNA 2 μL、稀釋至10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s，根據(jù)引物說明書設(shè)定的退火溫度反應(yīng)20 s，95 ℃ 15 s，退火溫度反應(yīng)1 min,重復(fù)40個循環(huán)，95 ℃ 15 s。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.5 血清IL-27、IFN-γ、IL-4水平檢測 血清常溫解凍，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標(biāo)儀測得吸光度值，計算各樣本血清中細(xì)胞因子的濃度。全自動酶標(biāo)儀購自北京新天橋技術(shù)有限公司。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血中樹突狀細(xì)胞比例比較 哮喘組外周血中IL-27+樹突狀細(xì)胞比例(28.717%±2.608%)較對照組(43.077%±2.670%)低，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 兩組外周血中IL-27亞基、Th1、Th2相關(guān)基因表達比較 與對照組比較，哮喘組外周血中IL-27兩個亞基p28及EBI3的mRNA表達低(P均<0.05)，Th1相關(guān)基因T-bet表達、T-bet/GATA3低(P<0.05)，Th2相關(guān)基因GATA3表達兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組外周血中IL-27、Th1、Th2相關(guān)基因表達比較

2.3 兩組血清細(xì)胞因子水平比較 與對照組比較，哮喘組血清IL-27、IFN-γ水平低(P均<0.05)，血清IL-4水平高(P<0.05)。哮喘組血清IL-27水平與IFN-γ呈正相關(guān)(r=0.693，P<0.01)，與IL-4無相關(guān)性(r=0.259，P>0.05)。見表2。

表2 兩組血清細(xì)胞因子水平比較

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性的氣道炎性疾病，在全球范圍內(nèi)患病人數(shù)高達3億。目前已有研究證實，Th1/Th2失衡是支氣管哮喘的主要發(fā)病原因[8]。IL-27是歸屬于IL-6/IL-12家族的一個二聚體蛋白，在外周血中，主要由樹突狀細(xì)胞合成及分泌[9]，而IL-27受體(IL-27R)則表達于樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞類型[10]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-27可以促進Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞分化[5]，而這種作用對多種自身免疫性疾病及炎癥性疾病有重要的影響。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，外源性IL-27干預(yù)可以減緩膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[11]及自身免疫性骨髓炎[12]的損傷，IL-27R基因敲除老鼠的病情更加嚴(yán)重；但在IL-27R基因敲除的炎癥性腸病老鼠的病理特征較野生型小鼠減輕[13]。提示IL-27在不同的疾病環(huán)境中可能存在抑制炎癥及促進炎癥的雙向調(diào)節(jié)功能。

Chae等[14]發(fā)現(xiàn)，IL-27的基因多態(tài)性與個體支氣管哮喘易感性相關(guān)；Matsuoka等[15]報道，花粉過敏的哮喘患者外周血PBMC中產(chǎn)生IL-27的樹突狀細(xì)胞數(shù)量和功能異常，血清IL-27水平較非過敏健康者低；陳杰等[16]也發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘兒童血清IL-27水平也較正常者低。然而，Xie等[17]研究發(fā)現(xiàn)，重度哮喘患者肺泡灌洗液細(xì)胞中IL-27 mRNA及蛋白表達均高。由此可見，IL-27在哮喘復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮怎樣的功能尚不明確，具體調(diào)控機制也未完全闡明。由于以往相關(guān)研究以動物實驗為主，而對人體的相關(guān)研究也多偏重于兒童，對成年支氣管哮喘與IL-27的相關(guān)性仍未得到證實。本研究發(fā)現(xiàn)，成年支氣管哮喘患者外周血中表達IL-27的樹突狀細(xì)胞比例低；IL-27的兩個亞基，p28及EBI3的mRNA表達、血清IL-27水平也比正常人低。由于本研究所收集支氣管哮喘患者均為門診病例，且要求過去4周內(nèi)未曾使用激素，因此均為輕度至中度哮喘患者。而重度哮喘患者IL-27水平升高，則可能與機體通過分泌IL-27反饋抑制過重的炎癥反應(yīng)有關(guān)。對于IL-27與哮喘嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究仍有待進一步探討。

T-bet與GATA3分別為Th1、Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，影響Th0細(xì)胞分化方向，在哮喘的發(fā)病過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-27可以通過上調(diào)T-bet的表達，促使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化[6]；作為IL-12家族成員之一，IL-27可通過上調(diào)IL-12受體β2的表達，使IL-12依賴的IFN-γ分泌增加[18,19]。本研究結(jié)果得出，哮喘組T-bet的mRNA表達、血清IFN-γ水平均較對照組低，且血清IL-27與IFN-γ水平呈正相關(guān)。另外，Artis等[20]提出，IL-27可能通過STAT1信號通路下調(diào)GATA3的表達，使Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等的表達降低，從而抑制Th2細(xì)胞分化。然而，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘組與對照組GATA3的mRNA表達無差異，且血清IL-27與IL-4水平不存在相關(guān)性。因此認(rèn)為，IL-27對Th2細(xì)胞的分化并非起到主要作用，支氣管哮喘發(fā)病過程中GATA3表達升高。IL-4分泌可能存在其他細(xì)胞因子的參與。

綜上所述，成人哮喘患者急性發(fā)作期外周血IL-27呈低表達，可為哮喘的診斷及治療提供新的方向。IL-27在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展過程中可能以促進Th1細(xì)胞分化，抑制炎癥反應(yīng)為主，對Th2細(xì)胞的作用仍有待進一步研究。

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