★ 張涵 索緒斌 張云凌* 姚琳 許慶瑞 張樹明 王偉明

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院 哈爾濱 150036；2.廣東藥科大學 廣州 510006)

肺炎支原體(mycoplasma pneumonia, MP)是引發(fā)社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的主要病原體之一，其引發(fā)的支氣管炎或者肺炎，不僅常見于嬰幼兒，也見于成人[1]。因其病程較長，且可引發(fā)哮喘及肺外癥狀，越來越受到學者們的關注。其發(fā)病機制可能與細胞黏附、社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合癥毒素破壞及機體免疫異常有關[2-5]。NLRP3炎性體是一種細胞內(nèi)模式識別受體，研究表明，肺炎支原體可被NLRP3識別，觸發(fā)機體的固有免疫應答以及炎癥反應，與肺炎支原體肺炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關[6]。清熱止咳方(芩百清肺濃縮丸)是一種治療肺炎支原體感染的中藥復方，實驗研究表明，其抗肺炎支原體肺炎與調(diào)節(jié)NLRP3炎性體有一定關系[7]。本文旨在探討其對MP感染模型小鼠肺組織NLRP3 炎性體mRNA表達及肺泡灌洗液中IL-18分泌動態(tài)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 實驗動物 SPF級BALB/c小鼠，6～8周，全部為雌性，購自中山大學動物實驗中心，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心負壓SPF級動物房；動物合格證號為SCXK (粵) 2011-0029，許可證號為SYXK (粵) 2014-0136。

1.1.2 菌株 肺炎支原體標準菌株(ATCC-15531)，為本實驗室保存。

1.1.3 藥物及試劑 清熱止咳方(每1g含生藥2.5g)，黑龍江省中醫(yī)藥科學院中藥研究所制備，制備方法同前[7]；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit及SYBR Premix Ex Taq 購自TaKaRa公司；NLRP3、ASC、Caspase-1引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；IL-18 ELISA試劑盒購自ebioscience公司。

1.1.4 主要儀器 CFX96熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；3k-20z型高效冷凍離心機，1300 SERIES A2二級生物安全柜，美國 thermo公司；GEN ios pro酶聯(lián)免疫檢測儀，瑞士NAVO公司。

1.2 方法

1.2.1 肺炎支原體培養(yǎng) 將凍存的MP標準菌株用PPLO完全培養(yǎng)液復溶，將其置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液變橙黃色時傳代。把處于對數(shù)生長期的MP，行顏色改變單位(CCU)定量并分管凍存，用時調(diào)至所需濃度。

1.2.2 分組、接種MP及給藥 96只雌性BALB/c小鼠，隨機分為正常對照組、MP組、羅紅霉素組(50mg/Kg)、清熱止咳方組(3.3g/Kg)，每組24只，各組小鼠分籠飼養(yǎng)，其中正常對照組小鼠與其他組小鼠分房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境和條件均一致。各組小鼠，均用乙醚麻醉，參照文獻方法[9]，滴鼻法建立肺炎支原體感染小鼠模型。正常對照組小鼠同法用等容量的PPLO代替MP菌液滴鼻。滴鼻后第1d，羅紅霉素組及清熱止咳方組開始給藥，給藥容量為10 mL/Kg，連續(xù)給藥14d。模型組及正常對照組灌服相同容量蒸餾水。

1.2.3 標本的采集及保存 分別于MP感染模型建立后第7d、14d及28d，每組隨機取出小鼠8只，頸椎脫臼法處死，并用75%乙醇消毒，在生物安全柜內(nèi)分離氣管，結扎右主支氣管，氣管插管，從氣管插管處慢慢注入0.5mL 4℃預冷的PBS溶液，30s 后緩慢的抽出，此步驟重復三次，合并BALF，4℃ 3000rpm離心10min，分離上清，于-80℃保存，備做ELISA；分離左肺，-80℃凍存，備提RNA。

1.2.4 NLRP3、ASC、caspase-1mRNA相對表達量檢測 常規(guī)方法提取各組小鼠左肺的RNA，并測定濃度。參照試劑說明書進行逆轉錄及PCR擴增，NLRP3、ASC、caspase-1mRNA引物序列及擴增條件參見文獻[7]。用2-ΔΔCt法分析PCR產(chǎn)物的相對定量。

1.2.5 IL-18檢測 用ELISA方法測定，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 清肺止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1mRNA相對表達量的動態(tài)變化 與正常對照組比較，感染后7d、14d模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達量均顯著上調(diào)(P<0.01)；感染后28d模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達量無明顯變化，與正常對照組比較，沒有顯著性差異(P>0.05)；清熱止咳方組給藥后7d、14d NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達量均下降，與模型組比較，差異有顯著性(P<0.05)。給藥后28d清熱止咳方組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA相對表達量無明顯變化，與模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)。見表1-3。

表1 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織NLRP3 mRNA表達的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

表2 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織ASC mRNA表達的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

表3 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織caspase-1 mRNA表達的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠BALF IL-18的影響 MP感染后7d、14d，模型組小鼠BALF中IL-18分泌量增加，與正常對照組比較，差異有顯著性(P<0.01)；感染后28d模型組小鼠BALF中IL-18分泌量稍有增加，但與正常組比較，無見顯著性差異(P>0.05)。給予清肺止咳方 7d、14d，小鼠BALF中IL-18分泌量減少，與模型組比較，差異有顯著性 (P<0.05，P<0.01)。清熱止咳方給藥14d，再停止給藥14d，與模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)。結果見表4。

表4 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠BALF IL-18分泌的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

NOD樣受體蛋白3即NLRP3炎性體是由NLRP3、ASC、Caspase-1組成的一種多蛋白復合物，屬于胞內(nèi)識別受體，它在巨噬細胞、樹突狀細胞等多種細胞中表達，在多種感染性及非感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮作用[8-9]。

研究表明，細胞感染肺炎支原體后，活性氧以及肺炎支原體特有的社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素均可被NLRP3炎性體識別，并激活NLRP3，通過與銜接蛋白ASC作用，活化caspase-1，進而裂解無活性的pro-IL-1β，將其剪切為成熟的IL-1β，并介導一系列炎癥反應，在肺炎支原體肺炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[6,10]。

本研究通過MP滴鼻法建立BALB/c小鼠感染模型，通過體內(nèi)實驗進一步動態(tài)觀察了NLRP3炎性體相關基因及IL-18在MP感染小鼠肺組織或BALF的變化，結果發(fā)現(xiàn)，小鼠接種MP 7d，NLRP3炎性體相關基因表達上調(diào)，BALF中IL-18分泌明顯增加；感染14d NLRP3炎性體相關基因表達及BALF中IL-18分泌雖較7d下降，但還高于正常對照組，即炎癥有所減退；感染28d，NLRP3炎性體相關基因表達及BALF中IL-18分泌無明顯變化，即炎癥基本消失。其中，NLRP3炎性體相關基因表達的變化趨勢與其相關蛋白表達的變化趨勢基本一致[7]。前期體外試驗結果顯示，MP感染RAW264.7細胞后，細胞上清液IL-18的分泌量未有明顯變化，但本文整體動物試驗結果表明，IL-18在肺炎支原體感染初期和中期分泌增加，感染后期分泌趨于正常，可能是由于體外試驗中選取的時間點不同，抑或由于體外試驗脫離了體內(nèi)試驗的內(nèi)環(huán)境，故兩者結果不甚一致，具體原因有待于進一步研究[11]。

清熱止咳方是治療肺炎支原體感染的中藥復方，方中以黃芩為君藥，以其苦寒之性，清泄肺火；百部為臣藥，甘、苦、微溫，可潤肺止咳；地龍性寒、味咸，可清熱、止喘；桔梗味苦、辛、性平，可宣肺、利咽、祛痰、排膿，并輔以麥冬、紫菀，全方共奏清熱解毒、潤肺止咳的功效。前期體外實驗研究表明，清熱止咳方含藥血清能降低MP感染小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞NLRP3炎性體相關基因的相對表達量并減少肺泡灌洗液IL-1β的分泌，本研究通過體內(nèi)實驗，從NLRP3炎性體相關基因表達變化的角度探討其治療肺炎支原體感染的作用機制。結果表明，給予中藥復方清熱止咳方7d、14d后能下調(diào)MP模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達及BALF中IL-18的分泌。即清熱止咳方可能通過抑制NLRP3炎性體相關基因表達而抑制相關炎性細胞因子IL-18的分泌來發(fā)揮對肺炎支原體感染的治療作用。

[1]Liu H, Xiao XC, Lu JY, et al. Study on epidemic characteristics and etiology of community acquired pneumonia in Guangzhou from 2009 to 2012. Chin J Prev Med, 2013, 47(12): 1 089-1 094.

[2]Balish MF. Mycoplasma pneunomiae attachment proteins and toxins as mediators in disease production[J].Curr Pediatr Rev, 2013, 9(4): 296-303.

[3]Kannan TR, Musatovova O, Balasubramanian S, et al. Mycoplasma pneumonia community acquired respiratory distress syndrome toxin expression reveals growth phase and infection dependent regulation[J].Mol Microbiol, 2010, 76(5): 1 127-1 141.

[4]Becker A, Kannan TR, Taylar AB, et al. Structure of CARDS toxin, a unique ADP-ribosylating and vacuolating cytotoxin from Mycoplasma pneumonia[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(16):5 165-5 170.

[5]李沫民, 柳旎, 張淼, 等. 肺炎支原體感染患兒的免疫水平研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志, 2017, 27(16): 3 795-3 797,3 836.

[6]張涵, 馬晶, 張云凌, 等. 肺炎支原體經(jīng)ROS激活NLRP3炎性體誘導RAW264.7細胞分泌IL-1β[J].中國病理生理雜志, 2015, 31(12): 2 244-2 248.

[7]張涵, 索緒斌, 張云凌, 等. 芩百清肺濃縮丸對肺炎支原體感染BALB/c小鼠NLRP3炎性體的影響[J].中國病原生物學雜志, 2017,12(10): 943-946.

[8]Eun-Kyeong Jo, Jinkyung Kim, Dong-Min Shin, et al. Molecular mechanisms regulating NLRP3 inflammasome activation[J].Cell Mol Immunol, 2016,13(2):148-159.

[9]毛開睿,孫兵. NLRP3炎癥小體研究進展[J].現(xiàn)代免疫學雜志, 2011, 31(1): 1-4.

[10]Bose S, Segovia JA, Somarajan SR, et al. ADP-ribosylation of NLRP3 by Mycoplasma pneumoniae CARDS toxin regulates inflammasome activity[J].mBio, 2014,5(6): e02186-14.

[11]張涵, 馬晶, 張云凌, 等. 肺炎支原體感染RAW264.7細胞NLRP3炎性體及下游分子的表達[J].中國病原生物學雜志, 2014, 9(6): 496-499.