張曉沖，戴勝，曹井相

(1.安徽中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖張恒春醫(yī)藥有限公司銷(xiāo)售部，安徽 蕪湖 241006)

藥用金銀花又名雙花、忍冬花，為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。種植及應(yīng)用歷史悠久，是傳統(tǒng)、常用中藥材。具有清熱解毒、宣散風(fēng)熱等功效[1]。我國(guó)是金銀花的重要產(chǎn)地之一，多地都可種植，其中山東、河北、河南是較出名的三大產(chǎn)地。近年來(lái)金銀花的需求量不斷攀升，而安徽省蕪湖市的氣候也非常適合種植金銀花，因此選用蕪湖產(chǎn)的金銀花進(jìn)行了含量測(cè)定?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)安徽蕪湖產(chǎn)地金銀花質(zhì)量研究分析較少，為了客觀評(píng)價(jià)、充分利用安徽蕪湖產(chǎn)地藥材資源，并有效控制藥材質(zhì)量，根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》第一部[2]，運(yùn)用HPLC法測(cè)定了金銀花中有效成分綠原酸含量，對(duì)安徽蕪湖產(chǎn)金銀花藥材質(zhì)量進(jìn)行了初步研究，為蕪湖產(chǎn)金銀花質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Agilent Technologies 1260 (美國(guó)安捷倫公司，二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD紫外檢測(cè)器)；色譜柱(Agllent HC-C18,5 μm,4.6×250 mm)；XL-130多功能粉碎機(jī)(永康市小寶電器有限公司，31000 r/min，650 W) ；FA1204N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；KH3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Sigma 2-16KL高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；AP-01P真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；基因型 1850A摩爾純水機(jī)(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)。

綠原酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.39%，批號(hào) 17030620)，對(duì)照品由北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)和北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院聯(lián)合研制。甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA,16085016);乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA, 16085016)；磷酸(色譜純，上海展云化工有限公司，批號(hào)160815)；超純水(實(shí)驗(yàn)室制備)。金銀花采集自安徽蕪湖丫山、蕪湖安徽中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥園、蕪湖安徽中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校草場(chǎng)，購(gòu)買(mǎi)的為山東平邑產(chǎn)金銀花，共8個(gè)批次。經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校李林華講師鑒定，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agllent HC-C18,5μm,4.6×250mm，柱溫30℃[3]，波長(zhǎng)為327nm[4]，流速為1mL/min，進(jìn)樣量20μL，以乙腈(A)-0.4%磷酸(B)為流動(dòng)相洗脫[5]。理論塔板數(shù)不低于3000。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.7mg，至于5mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1.14mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備。取干燥、粉碎過(guò)的金銀花粉末(過(guò)60目篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，放入碘量瓶中，精密加入50%甲醇25 mL稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min[6]，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足損失，離心10 min，12000 r/min，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm一次性過(guò)濾器，濾液即為供試品溶液。采集及購(gòu)買(mǎi)的金銀花來(lái)源詳見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

將對(duì)照品溶液稀釋2、4、8、16、32、64倍，搖勻，按照上述色譜條件進(jìn)樣，并記錄色譜峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并線性回歸。回歸方程及線性范圍見(jiàn)圖1。Y=33784x+122,R2=0.9995,R=0.9997。線性范圍8.9～570 μg。結(jié)果表明，對(duì)照品線性關(guān)系良好。

2.2 精密度考察

精密吸取對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣20μL，以對(duì)照品峰面積進(jìn)行計(jì)算，RSD為0.11 %[7]。結(jié)果表明，對(duì)照品精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取待測(cè)金銀花LJT1號(hào)為供試品溶液，按照上述2.1項(xiàng)下的色譜條件，分別在2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣[8]，測(cè)定綠原酸的峰面積RSD為1.38 %，表明樣品液在24h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果表明，對(duì)照品穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取待測(cè)金銀花LJT1號(hào)粉末約0.1g，平行稱(chēng)定3份，按照上述2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液6份，每份精密吸取20μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定有效成分綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.92%。結(jié)果表明，對(duì)照品重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率

取金銀花LJT1號(hào)粉末6份，每份約0.5g，精密稱(chēng)定，每份加入相同量的綠原酸對(duì)照品，按照2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，平均回收率為103.15%，RSD為1.97%[9]。結(jié)果表明，對(duì)照品回收率良好。

2.6 樣品測(cè)定

取不同批號(hào)的金銀花藥材約1.0g，精密稱(chēng)定，按2.2.2項(xiàng)下方法[10]、條件操作，制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，并計(jì)算綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[11]，結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖見(jiàn)圖3。

表1 金銀花的來(lái)源

表2 金銀花藥材中有效成分的測(cè)定結(jié)果

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 金銀花混合樣品在波長(zhǎng)327nm下HPLC圖

圖3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在波長(zhǎng)327nm下HPLC圖

3 結(jié)論與討論

3.1 提取溶劑的選擇：參照2015版《中國(guó)藥典》金銀花含量測(cè)定項(xiàng)下的樣品處理方法，對(duì)比了水、純甲醇、50%甲醇作為溶劑，經(jīng)過(guò)篩選，表明以50%甲醇為溶劑效果最好。參考文獻(xiàn)后，采用了超聲提取法進(jìn)行提取。

3.2 本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了篩選：通過(guò)對(duì)純甲醇，甲醇-水和乙腈-水的篩選，發(fā)現(xiàn)乙腈-水的洗脫效果更理想，為抑制峰的拖尾，加入冰醋酸和磷酸進(jìn)行篩選，結(jié)果表明,以乙腈(A)-0.4%磷酸(B)為流動(dòng)相峰型較好。

3.3 本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定了購(gòu)買(mǎi)的金銀花(山東平邑產(chǎn))中金銀花中綠原酸的含量，和在蕪湖丫山和安徽中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥園采摘的金銀花2個(gè)產(chǎn)地不同批次的金銀花中綠原酸的含量，其中丫山產(chǎn)(野生)金銀花中綠原酸含量均高于藥典規(guī)定含量(1.5%)，平均含量為2.1%；安徽中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥園及藥園外采摘的金銀花有效成分含量較低，與該藥材為人工栽培的改良后的金銀花品種有關(guān)。

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