徐琳煜， 劉守贊，白 巖，丁 恒， 胡曉甜， 吳學(xué)謙，許海順， 鄭炳松

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 植物園，浙江 杭州311300）

三葉青Tetrastigma hemsleyanum是葡萄科Vitaceae崖爬藤屬Tetrastigma的一種珍稀中草藥［1］，具有抗炎、 鎮(zhèn)痛等作用［2］， 臨床上常用來抑制結(jié)腸癌［3］、 食管癌［4］、 肺癌［5－6］等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。因其藥理作用明顯，致使采挖量逐年增加，林下野生三葉青瀕臨滅絕。近年來，為滿足醫(yī)療需求，人工栽培面積不斷擴(kuò)大。三葉青在全光照下生長不良或死亡，探尋其適宜生長的光照條件勢在必行。在藥用植物生長過程中，光強(qiáng)影響其光合作用，進(jìn)而影響其質(zhì)量和產(chǎn)量［7］。萬小燕［8］對3種藥用植物進(jìn)行了遮光處理，發(fā)現(xiàn)遮光影響涼粉草Mesona chinensis形態(tài)特征與光合性能，適當(dāng)遮光可以提高三甲仙草Mesona paruifsota和越南仙草Mesona procumbens的凈光合速率。李婷等［9］研究發(fā)現(xiàn)：光強(qiáng)過高或過低都會(huì)影響穿心蓮Andrographis paniculata主要藥用成分，隨光強(qiáng)增加，穿心蓮內(nèi)酯（AND）量值變低，脫水穿心蓮內(nèi)酯（DDAND）變高。秦健等［10］發(fā)現(xiàn)青錢柳Cyclocarya paliurus幼苗隨著光強(qiáng)增加其根莖葉生物量及總生物量呈現(xiàn)上升趨勢。光照對三葉青的光合特性的影響研究已逐漸起步，劉崟艷等［11］通過不同產(chǎn)地三葉青植株的蒸騰作用與氣孔結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)浙江臺州等地的三葉青葉片均在弱光條件下時(shí)蒸騰速率最小、凈光合速率最高；楊華等［12］研究了不同遮光條件下三葉青的光合特性，認(rèn)為15%光照下其光合作用較好；錢麗華等［13］和彭昕等［14］發(fā)現(xiàn)光周期可調(diào)控三葉青葉片愈傷組織的生長及總黃酮量，結(jié)果顯示12 h·d－1間斷性光照最有利于愈傷組織的生長，24 h·d－1光照最有利于黃酮類化合物的累積。本研究著眼于研究不同光強(qiáng)下三葉青的光合指標(biāo)的特性（凈光合速率Pn，最大凈光合速率Pmax，光補(bǔ)償點(diǎn)LCP，光飽和點(diǎn)LSP，表觀量子效率AQE，氣孔導(dǎo)度Gs，胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)Ci，蒸騰速率Tr等），并進(jìn)一步討論其變化及規(guī)律，作為篩選三葉青生長的最佳光強(qiáng)條件依據(jù)，進(jìn)行林下仿生栽培，有利于增加三葉青的產(chǎn)量，提高藥材品質(zhì)，滿足醫(yī)藥需求。

1 材料與方法

1.1 材料處理

選用2年生三葉青扦插苗為試驗(yàn)材料，研究于2015年3－8月在浙江農(nóng)林大學(xué)森林培育智能溫室和省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

三葉青苗進(jìn)行盆栽， 栽培基質(zhì)按 m（泥炭）∶m（田園土）∶m（珍珠巖）∶m（牛糞）＝4∶4∶4∶1 比例配比制成。遮陽網(wǎng)棚下緩苗1個(gè)月后，選取生長健壯、無病蟲害、苗高大小近似的三葉青苗20盆，隨機(jī)分為5組，4盆·組－1，對照組為全光照，采用白色全透光防蟲網(wǎng)遮蓋，其余4組分別放在遮光度為30%，50%，70%，90%的遮陽棚里（以市售70%的遮陽網(wǎng)為基礎(chǔ)，利用剪刀修剪透光空洞的大小及密度，單層或雙層覆蓋，并用照度計(jì)測定透光率，以確保遮光度達(dá)到設(shè)計(jì)要求。測定時(shí)間選擇晴朗無云的中午12：00，隔半個(gè)月測定1次，及時(shí)調(diào)整誤差，確保遮光程度穩(wěn)定、準(zhǔn)確），遮陽網(wǎng)覆蓋住棚的頂部及四周。澆水、除草等日常養(yǎng)護(hù)工作按照常規(guī)種植三葉青方法，定期進(jìn)行。

指標(biāo)測定分別選在快速生長期（6月末，即處理后70 d左右）和高溫緩慢生長期［15］（8月初，即處理后100 d左右）進(jìn)行?？焖偕L期的數(shù)據(jù)標(biāo)記為Ⅰ-ck,Ⅰ-30%,Ⅰ-50%,Ⅰ-70%和Ⅰ-90%，高溫緩慢生長期的數(shù)據(jù)標(biāo)記為Ⅱ-ck，Ⅱ-30%，Ⅱ-50%，Ⅱ-70%和Ⅱ-90%。

1.2 儀器與試劑

便攜式光合系統(tǒng)測定儀（LI-6400XT），紫外分光光度計(jì)（UNICO-3802），照度計(jì)（TES1339），體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇等。

1.3 葉片光合色素測定

三葉青光合色素測定采用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇浸提法［16］。將采回的樣品洗凈擦干，去中脈，剪碎，稱取0.1 g，加入體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇5.0 mL，在黑暗中泡48 h至葉片完全變白即可測定。以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇作為空白對照，記錄波長665，649，470 nm處吸光度。代入相應(yīng)公式計(jì)算相關(guān)光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg·g－1）。 w（葉綠素 a）＝［13.95D（665）－6.88D（649）］V/1 000m； w（葉綠素 b）＝［24.96D（649）－7.32D（665）］V/1 000m； R（葉綠素 a/b）＝w（葉綠素 a）/w（葉綠素 b）； w（總?cè)~綠素）＝w（葉綠素 a）＋w（葉綠素b）； w（類胡蘿卜素）＝［1 000D（470）－2.05w（葉綠素 a）－114.80w（葉綠素 b）］V/（1 000×245×m）。 其中： m為鮮葉質(zhì)量，V為葉綠素提取液總體積，D（λ）為吸光度。

1.4 葉片光合參數(shù)測定

光合測定于晴天上午進(jìn)行，利用LI-6400XT便攜式光合系統(tǒng)測定儀，選配紅藍(lán)光源的2 cm×3 cm標(biāo)準(zhǔn)葉室。設(shè)定一系列的光合有效輻射（PAR）梯度：0，50，100，150，200，300，400，600，800，1 000 μmol·m－2·s－1， 設(shè)定最少穩(wěn)定時(shí)間為 2 min， 二氧化碳濃度設(shè)定為 400 μmol·s－1， 葉室溫度設(shè)定為 29 ℃，氣體流速設(shè)定為500 μmol·s－1，相對濕度設(shè)定為70%左右。選擇不同重復(fù)處理下生長健壯的三葉青植株，各株選擇中上部大小、顏色相近似的葉片進(jìn)行測定，重復(fù)測定3次·株－1。記錄三葉青的凈光合速率（Pn）， 氣孔導(dǎo)度（Gs）， 胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)（Ci）和蒸騰速率（Tr）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用光合助手（Photosynthesis）軟件計(jì)算出光飽和點(diǎn)（LSP），光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP），量子效率（AQE），暗呼吸速率（Rd）和最大凈光合速率（Pmax），擬合光響應(yīng)曲線。運(yùn)用單因素方差分析法（one-way ANOVA）和最小顯著差法（LSD）進(jìn)行方差分析和多重比較（α＝0.05）。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同光強(qiáng)處理對三葉青光合色素的影響

三葉青光合色素測定結(jié)果見表1。經(jīng)遮光處理后，三葉青葉綠素a，葉綠素b，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的量隨著遮光程度的增加呈上升趨勢。葉綠素a，葉綠素b，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的量在遮光50%以上顯著增加，且在遮光90%出現(xiàn)最大值；葉綠素a/b值呈降低趨勢，遮光50%以上差異顯著（P＜0.05）。分析認(rèn)為，光合色素的合成受光強(qiáng)影響，其中葉綠素在植物光合作用中具有吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能的作用，而類胡蘿卜素為光吸收的輔助色素，對植物具有光保護(hù)作用。

在高溫緩慢生長期，全光照（ck）和遮光30%的葉片色素量有所降低，葉綠素a/b比值增加，其余各組色素的量均上升，葉綠素a/b比值下降。葉綠素a的最大吸收在長波紅光區(qū)（680 nm），葉綠素b的最大吸收在短波藍(lán)光區(qū)（460 nm）。葉綠素a/b變小反映植物對外界短波光吸收量的相對增加,說明在遮光30%以下三葉青葉片光合系統(tǒng)吸收過量的光能，導(dǎo)致光合色素的反應(yīng)中心的失活或損害，遭受了強(qiáng)光脅迫，各生物量下降，合成光合色素需要的物質(zhì)供給減少，因而光合色素總量降低，生長不適應(yīng)；在遮光50%以上，未產(chǎn)生強(qiáng)光脅迫，生長較適應(yīng)，也間接證明了三葉青具有較強(qiáng)的耐陰性。

表1 不同光強(qiáng)處理對三葉青葉片色素的影響Table 1 Effects of different light intensity on photosynthetic pigments content of Tetrastigma hemsleyanum with different light intensity treatments

2.2 不同光強(qiáng)處理對三葉青光合-光響應(yīng)曲線的影響

如圖1所示：各遮光處理三葉青的光合-光響應(yīng)曲線變化趨勢基本一致?？傮w而言，當(dāng)PAR在0～200 μmol·m－2·s－1時(shí)，Pn迅速升高；PAR在 200～400 μmol·m－2·s－1時(shí)， Pn上升速度減緩；當(dāng) PAR＞600 μmol·m－2·s－1時(shí)，遮光50%以上的Pn趨于穩(wěn)定，而遮光30%和ck的Pn呈現(xiàn)降低趨勢。隨遮光程度增強(qiáng)，Pn呈現(xiàn)先增后降趨勢，遮光50%以上的Pn均高于ck，在遮光70%處理組達(dá)到最大值。處于高溫緩慢生長期時(shí)，各處理下Pn均比快速生長期有所降低。

圖1 不同光強(qiáng)處理下三葉青光合-光響應(yīng)曲線Figure 1 Net photosynthetic rate （Pn）-light response curves of Tetrastigma hemsleyanum with different light intensity treatments

由表2可以看出：LSP，AQE和Pmax隨著遮光程度增加呈現(xiàn)先上升后降低趨勢，均在遮光70%達(dá)到最大值；LCP呈現(xiàn)下降趨勢，在遮光90%達(dá)到最小值，Rd的變化上下波動(dòng)，但均在遮光70%時(shí)達(dá)到最大值。與快速生長期相比，高溫緩慢生長期相同遮光處理下的LSP，AQE，Rd，Pmax數(shù)值均下降，而LCP則呈現(xiàn)上升趨勢，與ck相比，LSP，AQE，Rd在50%以上差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同光強(qiáng)處理對三葉青Gs，Ci，Tr的影響

氣孔是植物與外界進(jìn)行氣體交換和蒸騰作用的通道，因此，Gs的大小決定二氧化碳和水進(jìn)出植物細(xì)胞的速率，進(jìn)而間接影響植物的光合作用和蒸騰速率。由圖2可見：各處理均呈現(xiàn)先快速上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，其中，遮光50%～90%處理的Gs均高于遮光30%和全光照，表明可能三葉青在長期的強(qiáng)光脅迫下可導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，故Gs下降。快速生長期的Gs最大值出現(xiàn)在遮光70%（54.33 mmol·m－2·s－1），高溫緩慢生長期各處理下Gs在均有所降低，最大值為遮光50%（30.02 mmol·m－2·s－1）。分析認(rèn)為，夏季的高溫及高光強(qiáng)使三葉青生長滯緩，氣孔開閉不活躍，各處理Gs均降低。

表2 不同光強(qiáng)處理下三葉青的光合響應(yīng)曲線特征參數(shù)Table 2 Characteristic parameters of photosynthetic response curve of Tetrastigma hemsleyanum with different light intensity treatments

由圖 3可知： 當(dāng)PAR在 0～200 μmol·m－2·s－1時(shí)， 不同遮光處理下三葉青的 Ci快速下降， 并在之后隨光強(qiáng)增加，各處理的Ci處于低水平；不同生育時(shí)期的三葉青Ci差異不大。一般而言，Ci大小取決于4個(gè)因素：葉片周圍空氣中的二氧化碳濃度，Gs，葉肉導(dǎo)度（gm）和葉肉細(xì)胞的光合活性［18］。當(dāng)葉片周圍空氣二氧化碳濃度升高，Gs和gm增大，葉肉細(xì)胞的光合活性降低時(shí)，Ci會(huì)增大；反之，Ci則減小。本研究中，不同遮光處理下三葉青的Ci先快速下降，后保持穩(wěn)定，與光合響應(yīng)曲線的變化趨勢負(fù)相關(guān)。隨著光照強(qiáng)度的增加，三葉青進(jìn)行光合作用，二氧化碳快速消耗，因此，Ci降低，Pn快速增加；不同生育時(shí)期，三葉青葉片的Ci與Pn變化趨勢一致，即都在高溫緩慢生長期下降，顯示該時(shí)期三葉青生長緩慢，Pn較低，對二氧化碳的消耗較少。

圖4顯示：隨著光照強(qiáng)度的增加，各處理的Tr均出現(xiàn)上升趨勢。三葉青屬于喜陰藥用植物，遮光可減少高光強(qiáng)傷害，并使氣孔活躍度增加［19］，故Tr隨Gs呈現(xiàn)上升趨勢。在快速生長期，Tr最大值（0.98 mmol·m－2·s－1）出現(xiàn)在遮光 70%處理組， 高溫緩慢生長期的 Tr最大值（0.58 mmol·m－2·s－1）出現(xiàn)在遮光 90%處理組，與Gs變化同步，或與盛夏高光強(qiáng)、高溫及低空氣濕度等因素有關(guān)［20］。

圖2 不同光強(qiáng)處理下三葉青Gs對光強(qiáng)的響應(yīng)Figure 2 Gsresponded to light intensity of Tetrastigma hemsleyanum

圖3 不同光強(qiáng)處理下三葉青Ci對光強(qiáng)的響應(yīng)Figure 3 Ciresponded to light intensity of Tetrastigma hemsleyanum

圖4 不同光強(qiáng)處理下三葉青Tr對光強(qiáng)的響應(yīng)Figure 4 Trresponsed to light intensity of Tetrastigma hemsleyanum

3 討論與結(jié)論

一般而言，光合色素含量的高低可在一定程度上直接反映植物光合效率的大小，并間接反映植物的生長狀況。植物在弱光條件下，為彌補(bǔ)光強(qiáng)不足，常通過增加色素含量以提升自身捕獲光能的能力，進(jìn)而更好地進(jìn)行有機(jī)物的合成和積累；反之，在強(qiáng)光條件下，色素含量會(huì)降低，這是植物的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)［20］。本研究中，隨著遮光程度的上升，三葉青葉綠素a，葉綠素b，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的量總體上呈現(xiàn)上升趨勢，與大多數(shù)研究結(jié)果一致［21－22］。在高溫緩慢生長期，對照和遮光30%的葉片色素量降低，其余各組色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升，說明在遮光30%以下三葉青葉片遭受強(qiáng)光脅迫，生長不適應(yīng)；在遮光50%及以上，則光強(qiáng)較為適宜，長勢良好。

光響應(yīng)曲線及各光合指標(biāo)變化是植物光合特性研究的主要內(nèi)容。三葉青在全光照時(shí)凈光合速率較低，對強(qiáng)光的利用能力不強(qiáng)，與金蓮花Trollius chinensis在全光照下長勢較差結(jié)果相同［23］。在90%遮光處理下，三葉青葉片的凈光合速率低于70%遮光處理，說明此遮光程度過高，三葉青可吸收的光能較少，導(dǎo)致其光合作用能力下降，不利于其生長及生物量積累［24－25］。對重樓Paris polyphylla［26－27］和半夏Pinellia ternata［28］的研究也表明它們在適宜的遮光下生長良好。有研究表明，低光補(bǔ)償點(diǎn)、高光飽和點(diǎn)的植物對復(fù)雜的光環(huán)境有更強(qiáng)的適應(yīng)性［29］，且量子效率越高，其耐陰性越強(qiáng)［30］。三葉青在遮光50%以上的光飽和點(diǎn)均顯著高于全光照，且光補(bǔ)償點(diǎn)值較低，說明其光合作用過程中暗反應(yīng)對同化力最大需求量較高，當(dāng)外界環(huán)境條件為遮光50%以上的弱光環(huán)境時(shí)，其利用光能利用率良好。其中，遮光70%的光飽和點(diǎn)達(dá)到最大值，光補(bǔ)償點(diǎn)值較低，且量子效率最高，說明遮光70%時(shí)三葉青生長最適宜。氣孔導(dǎo)度變化直接影響植物蒸騰速率,間接影響凈光合速率［31－32］。本研究結(jié)果亦符合該結(jié)論，尤其在高溫緩慢生長期，強(qiáng)光、高溫、低濕等環(huán)境條件使氣孔活躍度降低，進(jìn)而對三葉青光合作用及生理活動(dòng)產(chǎn)生脅迫，致使其生長滯緩。

本研究通過對不同遮光程度和不同生育時(shí)期下的三葉青光合生理特性比較研究，明確了其光合生理特性與光強(qiáng)之間的關(guān)系，并得出結(jié)論，適宜遮光可提高三葉青光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、凈光合速率、光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，不同生育時(shí)期各指標(biāo)均以遮光70%時(shí)最佳，與DAI等［33］結(jié)論相近，可為今后人工栽培和林下栽培提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。

4 致謝

本研究的試驗(yàn)材料由浙江省臺州市黃巖常柳植物科技有限公司提供，為小葉型高產(chǎn)三葉青品系。特此感謝！

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