張曉林 陳永對(duì) 穆野 趙立華 張潔 鄭雪

摘要：采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）侵染后辣椒和健康辣椒植株（CK）葉片中茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（jalicylic acid，SA）和茉莉酸-異亮氨酸（jasmonoyl isoleucine，JA-Ile）含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，SA含量在TZSV侵染24、48、96、120、144、168、192、216、240 h后顯著高于對(duì)照組；JA含量在TZSV侵染 8、24、72、96、144、216 h后顯著高于對(duì)照組；JA-Ile含量在TZSV侵染 24、48、72、96、144、216 h后顯著高于對(duì)照組。 TZSV侵染可使辣椒SA、JA及其衍生物JA-Ile含量增加。

關(guān)鍵詞：番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒；辣椒；茉莉酸；水楊酸；茉莉酸-異亮氨酸

中圖分類號(hào)：S436.418.1+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）04-0094-04

Abstract The contents of salicylic acid （SA）， jasmonic acid （JA） and jasmonoyl-isoleucine （JA- Ile） in pepper leaves between plants infected with TZSV and healthy plants（CK） were determined by the high performance liquid chromatography （HPLC） method. The results showed that the content of SA was significantly higher than CK at 24，48，96，120，144，168，192，216 and 240 h after TZSV infection. The content of JA was significantly higher than CK at 8，24，72，96，144，216 h after TZSV infection. The content of JA-Ile was also significantly higher than CK at 24，48，72，96，144，216 h after TZSV infection. The results indicated that TZSV infection could increase the contents of SA， JA and JA-Ile in pepper.

Keywords Tomato zonate spot virus； Pepper；Jasmonic acid； Salicylic acid； Jasmonoyl-isoleucine

番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）屬于布尼亞科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），于2008年在云南省首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1]。TZSV病毒是一種RNA病毒，植物感染該病毒后，新葉上首先出現(xiàn)黃色同心環(huán)紋或環(huán)形帶狀褪綠斑點(diǎn)，之后由黃斑轉(zhuǎn)變?yōu)榭莅?，葉片出現(xiàn)黃化、凋零，造成整葉或半葉呈紅褐色壞死。感病植株還會(huì)出現(xiàn)矮化、頂芽萎蔫下垂、葉片皺縮退綠等癥狀。TZSV寄主植物廣泛，包含茄科、菊科、蓼科、藜科、豆科、蔥科、鳶尾科共7 科的25 種植物，對(duì)云南省番茄、辣椒、煙草、花卉等經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2，3]。

病毒侵染可造成植物防御次生物質(zhì)含量、解毒和防御相關(guān)酶活性的改變，并對(duì)植物感知昆蟲危害啟動(dòng)相應(yīng)的防御反應(yīng)產(chǎn)生干擾。研究表明茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid，SA）作為植物激素是目前已知的參與高等植物防御反應(yīng)的一類重要的信號(hào)物質(zhì)[4]。SA在植物對(duì)病原菌的過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性中起主要作用[5]。在蟲害誘導(dǎo)的直接和間接防御反應(yīng)中，JA是植物誘導(dǎo)傷害反應(yīng)的一種重要信號(hào)分子，其衍生物茉莉酸-異亮氨酸（jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile）是JA生成的關(guān)鍵底物之一，主要誘導(dǎo)植物產(chǎn)生各種抗性[6，7]。研究表明煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）對(duì)煙草的侵染可能抑制了植物對(duì)昆蟲取食的防御反應(yīng)，這種抑制作用很可能是由病毒侵染導(dǎo)致寄主植物內(nèi)源SA含量的上升對(duì)JA途經(jīng)的抑制引起的[8]。中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）侵染煙草，可抑制植物JA防御途徑，提高B型煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）對(duì)寄主植物的適應(yīng)性[9]。

本試驗(yàn)以TZSV-辣椒互作為切入點(diǎn)，研究辣椒感染TZSV前后SA、JA、JA-Ile等相關(guān)防御物質(zhì)含量的變化，為下一步解析TZSV侵染誘導(dǎo)的寄主植物防御相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯菲贩N為Zunla-1號(hào)，由遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。人工氣候室中栽培，栽培條件：溫度25℃，濕度60%，光照時(shí)間16 h/d。

供試TZSV毒源來源于云南元謀的番茄葉片。

1.2 試驗(yàn)方法

TZSV侵染辣椒植株的人工接種方法：將含有TZSV毒源的番茄葉片加入接種緩沖液研磨直至汁液溢出，用棉簽蘸取少量汁液，在灑了少許金剛砂的辣椒（苗齡為35 d）葉面上摩擦2～3次，10 min后用清水沖洗辣椒葉片。

試驗(yàn)設(shè)TZSV侵染辣椒植株和健康辣椒植株兩個(gè)處理組，以后者為對(duì)照。自TZSV侵染時(shí)開始計(jì)算，分別于8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h后選取TZSV侵染株和健康株相同部位的葉片0.15 g，重復(fù)取樣5次混勻備用。

1.3 測定指標(biāo)與方法

水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）檢測方法參見文獻(xiàn)[10，11]的方法并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室情況稍作改進(jìn)：將采集的葉片在液氮中研磨，稱取0.15 g于2.5 mL離心管，加入1 mL乙酸乙酯，后根據(jù)不同的測定指標(biāo)分別加入200 ng 13C2-JA（水楊酸的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）或D4-SA（茉莉酸的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）或香豆酸（茉莉酸-異亮氨酸的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)），將每個(gè)樣本在Fest Prep均質(zhì)器上均質(zhì)化，4℃最大速度離心10 min后將上清轉(zhuǎn)移到新的2 mL離心管中，再將沉淀物用0.5 mL乙酸乙酯進(jìn)行提取，離心分離，合并兩次上清液在真空濃縮器（Eppendorf）上干燥，后置于0.5 mL 70%甲醇（V/V）中并離心澄清。將上清液移到玻璃小瓶中，然后通過HPLC-MS / MS分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，使用Duncans新復(fù)極差法比較處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TZSV侵染辣椒植株中SA含量的變化

TZSV侵染株8 h后SA含量變化較為平穩(wěn)，96 h后開始下降，至168 h達(dá)到最低，為16.01 ng/gFW，216 h達(dá)到最大值205.14 ng/gFW，后迅速降低，240 h下降為41.50 ng/gFW。TZSV侵染組SA含量僅在侵染168 h后低于對(duì)照組，其余時(shí)間均高于對(duì)照組，且在侵染24、48、96、120、144、168、192、216、240 h時(shí)達(dá)顯著水平（表1）。

2.2 TZSV侵染辣椒植株中JA含量的變化

TZSV侵染株8 h時(shí)JA含量最高，為269.22 ng/gFW，之后逐漸下降，48 h后開始緩慢上升至72 h后開始回落，144 h后下降，至240 h后達(dá)到最低值，6.80 ng/gFW。TZSV侵染組JA含量在侵染后120、168、192 h低于對(duì)照組，但差異不顯著，在侵染后8、24、72、96、144、216 h則顯著高于對(duì)照組（表1）。

2.3 TZSV侵染辣椒植株中JA-Ile含量的變化

TZSV侵染株8 h后 JA-Ile含量迅速上升，并于24 h后達(dá)到最大值185.18 ng/gFW。在侵染48～96 h范圍內(nèi)變化較為平緩，而96 h后急劇下降，120 h后又急劇上升，144 h后開始回落。在168～240 h范圍內(nèi)變化較為平穩(wěn)，其中240 h后JA-Ile達(dá)最低值4.21 ng/gFW。TZSV侵染組JA-Ile含量僅在侵染后192 h低于對(duì)照組，但差異不顯著，其它時(shí)間均高于對(duì)照組，且在侵染24、48、72、96、144、216 h時(shí)達(dá)到顯著水平（表1）。

3 討論與結(jié)論

在植物對(duì)病蟲害的誘導(dǎo)防御反應(yīng)中，SA和JA被認(rèn)為是最重要的信號(hào)分子，在植物防御病原菌入侵過程中扮演著重要的角色[10，11]。SA是植物體內(nèi)含量較低的一種內(nèi)源酚類物質(zhì)，參與多種生理過程，是誘發(fā)植物系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance， SAR）產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)分子之一[10]。JA及其衍生物JA-Ile，是植物受昆蟲取食、機(jī)械傷害等誘導(dǎo)的內(nèi)源信號(hào)分子，可啟動(dòng)植物體內(nèi)抗病防御基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物的防御反應(yīng)，同時(shí)JA在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、光合特性、抗逆反應(yīng)等方面起著重要作用，參與病原菌及其昆蟲的誘導(dǎo)抗病并激發(fā)植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance， ISR）[11]。

植物受到病原菌侵染后會(huì)大量積累并誘導(dǎo)JA、SA含量上升及防衛(wèi)基因的表達(dá)。研究表明接種煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的煙草及接種煙草壞死病毒（Tobacco necrosis virus，TNV）的黃瓜，其SA含量顯著高于未接種病毒的健康植株[12，13]。以擬南芥、番茄等為材料的試驗(yàn)得到相同的結(jié)果[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，在TZSV侵染辣椒葉片后，除168 h外，其余時(shí)間TZSV侵染組SA含量均高于對(duì)照組，且在216 h時(shí)達(dá)到最大，而對(duì)照組SA含量變化波動(dòng)不大。JA-Ile是JA的關(guān)鍵底物之一，可能與JA的瞬時(shí)誘導(dǎo)合成以及移動(dòng)進(jìn)而抵御損傷脅迫有關(guān)。大豆、番茄、煙草、擬南芥在遭受損傷后，體內(nèi)JA、JA-Ile含量均顯著升高[15-17]；小麥感染白粉病后，JA含量也顯著高于健康植株[18]。本研究發(fā)現(xiàn)TZSV侵染組葉片中JA含量在120、168、192 h后雖稍低于對(duì)照組，但差異不顯著，其余時(shí)間下均高于對(duì)照組； JA-Ile含量僅在接種192 h時(shí)，TZSV侵染組稍低于對(duì)照組。本研究結(jié)果表明，TZSV侵染誘導(dǎo)了辣椒葉片中SA、JA、JA-Ile含量的上升，辣椒植株啟動(dòng)了抗TZSV相關(guān)的防御機(jī)制。

由水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的植物防御機(jī)制非常復(fù)雜，二者之間相互拮抗、又存在協(xié)同反應(yīng)，許多生物和非生物誘導(dǎo)因子都能激發(fā)水楊酸和茉莉酸的合成，激活防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)。在以后的研究中，應(yīng)深入探討水楊酸和茉莉酸途徑在調(diào)控寄主植物應(yīng)對(duì)TZSV 侵染防御反應(yīng)中的相互作用，明確水楊酸和茉莉酸抗病信號(hào)傳遞過程中的調(diào)控因子及關(guān)鍵基因，進(jìn)一步揭示TZSV侵染誘導(dǎo)的寄主植物防御相關(guān)機(jī)制。

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