陳曉峰 王承國 隋好林 牟晉華

摘要：本試驗主要研究大白菜α-微管蛋白基因受霜霉病菌誘導(dǎo)的表達特點以及病原菌侵染下微管動態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，霜霉病菌誘導(dǎo)后，大白菜抗、感病品種中兩種α-微管蛋白基因均呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達特點，且抗病品種葉片細胞微管結(jié)構(gòu)較為完整。說明微管骨架在植物對抗真菌病原菌侵染中具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：霜霉病菌；微管；α-微管蛋白；微管骨架

中圖分類號：S634.1+Q786文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0009-03

Abstract This paper mainly studied the expression characteristics of the α-tubulin protein gene induced by Peronospora parasitica and the dynamic structural changes of the microtubule under the infection of Peronospora parasitica. The results showed that α-tubulin protein genes expressed in all materials after Peronospora parasitica induction， and the microtubule cytoskeleton was more complete in the resistant variety. It indicated that the microtubule cytoskeleton had a certain function in plant against fungal pathogens.

Keywords Peronospora parasitica； Microtubule； α-tubulin； Microtubule cytoskeleton

微管是真核生物細胞的重要組成部分，在細胞形態(tài)發(fā)生、信號識別、細胞極性的建立等方面起著至關(guān)重要的作用[1，2]。在植物生長發(fā)育過程中，微管蛋白可以調(diào)節(jié)植物細胞以不同的形態(tài)來適應(yīng)環(huán)境和功能的需求，同時對植物纖維素和木質(zhì)素合成、構(gòu)建完整細胞骨架均具有重要作用[3]。植物微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白基因家族組成[2，4-7]。通過對α-微管蛋白基因家族研究發(fā)現(xiàn)，該基因家族具有保守性，其在結(jié)構(gòu)上非常相似，但在植物誘導(dǎo)表達和組織特異性表達上不盡相同[2，4]。

近幾年，關(guān)于微管骨架在植物抗性中的作用越來越受到重視，研究人員對其在改變植物生化特性、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response，HR）等一系列抗性反應(yīng)以及微管骨架參與植物和病原菌互作中的作用進行了研究[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，不同病原菌的侵染對微管骨架的結(jié)構(gòu)影響不完全相同，可見微管骨架在植物抗性反應(yīng)中的作用尚有需要明確的地方。而關(guān)于微管骨架在植物與病原菌互作中的動態(tài)變化，其調(diào)控因子以及在信號傳導(dǎo)中的作用等，仍然是未來研究的重點[13-16]。

本試驗對霜霉病菌誘導(dǎo)大白菜微管蛋白基因表達以及微管骨架受病原菌侵染在不同抗性材料中的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化進行了研究，以期了解細胞骨架在作物抗性反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

霜霉病菌、大白菜抗病品種“新煙雜3號”（XYZ-3）和感病品種“包頭蓮”（BTL）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院提供。大白菜種子消毒后，在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，待幼苗長至2～4片葉時用于試驗。

免疫熒光觀測所用果膠酶和纖維素酶、微管標(biāo)記抗體均采用Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 真菌接種液的制備和接種程序

霜霉病菌（Peronospora parasitica）接種液的制備和接種參照陳曉峰等[17]的方法，最終配成1×106個/mL孢子囊懸浮接種液。處理組每個單株葉片噴涂病原菌誘導(dǎo)液，對照組用純水代替。誘導(dǎo)處理后植株需遮光、保濕處理24 h，然后揭掉遮光物，于人工氣候箱內(nèi)20～25℃、12 h/12 h光周期、相對濕度（85±5）%條件下培養(yǎng)，直至采樣結(jié)束，每處理重復(fù)3次。

1.3 熒光定量PCR檢測P. parasitica誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達

1.3.1 引物設(shè)計 在GenBank大白菜數(shù)據(jù)庫中選取所需要的α-微管蛋白基因（Bra002261和Bra006517），引物設(shè)計參考文獻[2]，以大白菜肌動蛋白actin基因為內(nèi)標(biāo)基因，序列見表1。

1.3.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 提取處理和對照0、12、24、36、48、72、96 h大白菜葉片RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考陳曉峰等[17]的方法，每處理重復(fù)3次。

1.4 大白菜葉片細胞微管間接免疫熒光檢測

霜霉病菌誘導(dǎo)接種36 h后采集抗、感病大白菜植株葉片，參考張靜宜等[18]的方法進行微管免疫熒光觀測。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. parasitica誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達分析

從圖1可以看出，兩個微管蛋白基因均呈現(xiàn)先上升后下降的表達特點，在抗病品種中，兩個基因表達量均高于感病品種，經(jīng)霜霉病菌誘導(dǎo)12 h后表達量增加，誘導(dǎo)36 h均達到峰值，后逐漸下降；感病品種中，Bra006517基因表達變化趨勢與抗病品種中類似，Bra002261稍有不同，誘導(dǎo)12 h時表達量快速升高，誘導(dǎo)48 h后表達量明顯下降，72 h后恢復(fù)到起始表達量。

2.2 間接免疫熒光觀測大白菜葉片微管結(jié)構(gòu)差異

從圖2可以看出，病原菌誘導(dǎo)36 h后，抗、感病大白菜品種葉片中微管顯微結(jié)構(gòu)觀測結(jié)果不盡相同，抗病品種XYZ-3葉片細胞中圍繞細胞核周圍微管骨架結(jié)構(gòu)較為完整，感病品種BTL細胞周圍微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分散現(xiàn)象。

3 討論

目前，關(guān)于微管骨架與植物抗病性關(guān)系的研究主要集中在寄主過敏性壞死反應(yīng)（HR）和過氧化氫累積方面。通過物理和化學(xué)因素誘導(dǎo)微管解聚，會降低植物過敏性壞死細胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致植物對病原菌侵害抗性降低[2， 8-12，19]。通過對病原菌侵染植物組織進行免疫熒光觀測，發(fā)現(xiàn)微管骨架聚集于侵染點或接種點周圍[13-15]，說明微管蛋白基因表達量增加直接或者間接參與了植物的抗性反應(yīng)。

微管骨架廣泛存在于植物細胞結(jié)構(gòu)中，α-微管蛋白同分異構(gòu)體在細胞和特定組織存在空間和時間表達上的差異[2]。本研究中的兩種α-微管蛋白已被證實受紫杉醇、赤霉素（GA3）等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)表達[2]。本研究中我們對霜霉病菌侵染后抗、感病大白菜品種中α-微管蛋白基因表達量進行了分析，發(fā)現(xiàn)兩個α-微管蛋白基因受P. parasitica誘導(dǎo)表達，抗病品種中微管蛋白基因表達量略高于感病品種，說明微管蛋白基因可能參與植物應(yīng)對真菌病原菌侵染的抗性反應(yīng)。通過對葉片細胞中微管骨架的免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)抗病品種葉片細胞中微管骨架結(jié)構(gòu)比較完整，而感病品種細胞微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，這些都證明細胞骨架在真菌病原菌與寄主之間的抗性反應(yīng)存在一定的聯(lián)系。

下一步需要著重研究整個微管基因家族的誘導(dǎo)表達特性，以及微管蛋白表達量高底是否與植物細胞骨架的結(jié)構(gòu)變化有一定的關(guān)聯(lián)性，同時完善病原菌誘導(dǎo)植物細胞微管骨架的動態(tài)研究。

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