方玉麗,趙利華,蘇傳麗,陳樹燕,藤金龍,吳健文

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530023;3.佛山健翔醫(yī)院,佛山528000)

腦衰老可能是阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)等神經(jīng)退行性改變的最初級(jí)階段。AD也稱老年性癡呆,它的危害已經(jīng)作為全球性的公共衛(wèi)生問題被提出[1]。中晚期 AD的治療效果不佳,因此有學(xué)者提出,早期診斷與干預(yù),延緩腦衰老是治療 AD的一種新型戰(zhàn)略[2]。氧化應(yīng)激是衰老的重要因素之一,其病理改變主要見于海馬和大腦皮質(zhì),且隨著年齡增長(zhǎng)老齡動(dòng)物海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄水平降低,RNA、蛋白質(zhì)含量也會(huì)下降,而已有學(xué)者證實(shí) D-半乳糖處理小鼠的腦組織形態(tài)功能與上述相符合[3]。本研究通過 D-半乳糖注射建立小鼠衰老模型,以海馬和大腦皮質(zhì)中 SOD2、GADD45 mRNA、蛋白表達(dá)為觀察指標(biāo),從mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)分子水平探討艾灸療法對(duì)腦衰老的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

60只健康雄性 3月齡昆明雄性小鼠,體重(30±2) g。均由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK桂2003-0003)。按隨機(jī)數(shù)字表順序隨機(jī)分為5個(gè)組,每組12只,即生理組、模型組、艾炷灸“足三里＋懸鐘”穴組(艾灸1組)、艾炷灸“百會(huì)＋關(guān)元”穴組(艾灸2組)、艾炷灸非穴位組“腕上＋髕上”(非穴位組)。各組小鼠飼養(yǎng)條件均相同,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室[合格證號(hào) SYXK(桂)2010-001],室溫保持在(24±2)℃,相對(duì)濕度65%,12 h晝夜交替。自由攝食和飲用純凈水。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科技部2000年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

1.2.1 主要藥品和試劑

精制艾絨(蘇州東方艾絨廠出品);D-半乳糖[國(guó)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào) 20131105];0.9%氯化鈉注射液(貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào)A14051104);4%多聚甲醛固定液(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào)AR1069);SOD2、GADD45免疫組化試劑(美國(guó) Abcam公司);Sample Protector for RNA/DNA 9750,RNase-Free Water 9012,MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 9767(RNA提取),PrimeScriPt RT Master Mix(Perfect Real Time)RR036A(反轉(zhuǎn)錄),SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ RR820A,引物合成加驗(yàn)證(TaKaRa,大連寶生物);無水乙醇(上?；瘜W(xué)試劑一廠)。

1.2.2 主要儀器

超低溫冰箱(Thermo-Fishe,美國(guó));超聲波細(xì)胞破碎儀(BILON-650Y,上海比朗儀器有限公司);立式高壓滅菌鍋(上海博定實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠),AllegraX-22r低溫高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼康爾特有限公司),NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀(Thermo-Fisher,美國(guó)),9700 PCR擴(kuò)增儀(APPlied Biosystem,美國(guó)),7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(APPlied Biosystem,美國(guó)),奧林巴斯生物顯微攝影系統(tǒng)(BX60 PM20,日本),全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)(HM355S,MICROM德國(guó))。

1.3 造模方法

參照文獻(xiàn)[4]用 D-半乳糖頸背部皮下注射,建立亞急性衰老小鼠模型。將 D-半乳糖試劑與生理鹽水按10(g):100(mL)混勻?yàn)?100 mg/mL),水迷宮行為測(cè)試7 d后模型組、艾灸1組、艾灸2組、非穴位組連續(xù)70 d (10周)每天以D-半乳糖按1000 mg/kg/d頸背部皮下注射(相當(dāng)于每10 g體重注射0.l mL濃度為10%的D-半乳糖溶液),同時(shí)生理組按每10 g體重頸背部皮下注射0.l mL劑量的生理鹽水。

1.4 干預(yù)方法

造模12 d后,開始艾灸治療,每次3壯/穴,灸單側(cè)(或兩穴),共 6壯/d。穴位定位參照文獻(xiàn)[5-6]。每日 1次,共58次。

生理組和模型組不做任何治療性干預(yù),但給予與各治療組同樣時(shí)間、同等程度的捉抓、固定及放置未燃燒的艾炷等刺激。

艾灸1組取足三里、懸鐘。人工固定小鼠,先將穴位處剪毛,涂少量凡士林來保護(hù)小鼠的皮膚并使艾炷固定。艾炷規(guī)格為底部直徑1.5 mm,高6 mm,重約12～14 mg,要求緊而結(jié)實(shí)。艾炷燃燒時(shí)間約18～20 s/壯,至小鼠掙扎時(shí)更換。

艾灸2組取百會(huì)、關(guān)元,操作同艾灸1組。

非穴位組取腕背關(guān)節(jié)上1 mm(簡(jiǎn)稱腕上)和膝髕正中上沿上2 mm(簡(jiǎn)稱髕上),操作同艾灸1組。

1.5 取材

治療結(jié)束后,將各組小鼠斷頭于冰上取腦,每組 6只小鼠腦組織取海馬20 mg,大腦皮質(zhì)30 mg分別放入EP管于液氮﹣70℃保存,然后再轉(zhuǎn)移至﹣80℃超低溫冰箱保存,用作RT-qPCR試驗(yàn);每組另外6只小鼠斷頭后,完整取出一側(cè)半腦于4%多聚甲醛固定24 h,再行常規(guī)石蠟包埋,包埋后所有組織行連續(xù)冠狀切片。

1.6 檢測(cè)

1.6.1 免疫組化

小鼠腦組織SOD2、GADD45蛋白表達(dá)檢測(cè)均采用免疫組織化學(xué)二步法染色;石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化后,采用PBS液洗5 min×3次。采用檸檬酸液高壓修復(fù)(噴氣)2 min。每張切片加3% H2O2溶液,室溫孵育10 min,PBS液洗5 min×3次后甩干,滴加一抗抗GADD45抗體、抗MnSOD2抗體(1:100濃度稀釋),移至4℃冰箱孵育過夜。次日 PBS沖洗,滴加二抗,37℃孵育 1 h,PBS洗5 min×3次。甩去 PBS液,每張切片加 50 μL鼠PV-6001/2增強(qiáng)型(Polink-1)檢測(cè)試劑盒,室溫孵育30 min,PBS液洗5 min×3次,甩干后DAB顯色10 min。采用SP法,DAB顯色,陰性對(duì)照一抗以0.01 MPS液替代。在40倍物鏡下隨機(jī)選取皮質(zhì)和海馬區(qū)域不相重疊連續(xù)的 5個(gè)視野采集圖片,采用IPP軟件(Image-Pro Plus 6.0)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞染色結(jié)果進(jìn)行分析。分析方法為首先將 IPP程序系統(tǒng)進(jìn)行光密度校正,把圖片中神經(jīng)元細(xì)胞免疫組化反應(yīng)物的黃色區(qū)域定為測(cè)量區(qū)域(area of interest,AOI)進(jìn)行光密度測(cè)定,測(cè)量累積光密度(integrate doptical density,IOD)和面積(area),按下列公式計(jì)算平均光密度(average optical density):AOD=IOD/area。

1.6.2 RT-qPCR

從﹣80℃超低溫冰箱取出海馬組織及大腦皮質(zhì),加入裂解液后用一次性研磨杵進(jìn)行研磨裂解,后離心。海馬、大腦皮質(zhì)總RNA提取嚴(yán)格按TaKaRa試劑盒說明進(jìn)行,并對(duì)提取的總 RNA經(jīng)核酸測(cè)定儀進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定。根據(jù)總RNA的濃度(按照20 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))在 37℃下逆轉(zhuǎn)錄15 min,然后置于85℃5 s中停止逆轉(zhuǎn)錄,放置4℃ 15 min穩(wěn)定cDNA,再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SOD2、GADD45特異性引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列為SOD2(上游,TCCCAGACCTGCCTTACGA;下游,TCGGTGGCGT-TGAGATTG,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 115bP);GADD45(上游,CCTG-CACTGTGTGCTGGTGA;下游,CCACTGATCCATGTAGCGACTTTC,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 106bP);GAPDH(上游,TGTGTCCGTCGTGGATCTGA;下游,TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度150 bP),均購(gòu)買寶生物工程(大連)有限公司成品。反應(yīng)條件為先95℃預(yù)變性30 s,后95℃ 5 s,60℃30 s,共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。SOD2、GADD45結(jié)果以 2﹣ΔΔCt法表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析,符合方差齊性,均數(shù)間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益髓灸對(duì)小鼠海馬、大腦皮質(zhì) SOD2和 GADD45蛋白水平的影響

由圖1和圖2可見,各組小鼠海馬區(qū)、大腦皮質(zhì)均可見棕黃色陽性表達(dá)。生理組海馬和皮質(zhì)陽性表達(dá)細(xì)胞增加、染色深。模型組海馬和皮質(zhì)陽性表達(dá)細(xì)胞減少、染色淺。艾灸1組海馬和皮質(zhì)陽性表達(dá)細(xì)胞增加、染色深。艾灸2組海馬和皮質(zhì)陽性表達(dá)細(xì)胞增加、染色深。非穴位組海馬和皮質(zhì)陽性表達(dá)細(xì)胞減少、染色淺。由表1可見,模型組海馬區(qū)SOD2、GADD45蛋白水平較生理組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸1組和艾灸2組海馬區(qū)SOD2、GADD45蛋白水平較生理組降低,較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸1組與艾灸2組海馬區(qū)SOD2、GADD45蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);非穴位組海馬區(qū)SOD2、GADD45蛋白水平與生理組、艾灸1組和艾灸2組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。模型組大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45蛋白水平較生理組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸 1組、艾灸 2組大腦皮質(zhì)SOD2蛋白水平較生理組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而GADD45蛋白水平稍低于生理組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);艾灸1組和艾灸2組大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45蛋白水平較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸1組大腦皮質(zhì)SOD2水平低于艾灸 2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而兩組GADD45蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);非穴位組與生理組、艾灸1組和艾灸2組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。

圖1 光鏡下各組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)SOD2蛋白的表達(dá)

圖2 光鏡下各組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)GADD45蛋白的表達(dá)

表1 益髓灸對(duì)小鼠腦組織SOD2、GADD45蛋白水平的影響 (x±s)

2.2 益髓灸對(duì)小鼠海馬及大腦皮質(zhì) SOD2、GADD45 mRNA水平的影響

由表2可見,模型組海馬區(qū)SOD2、GADD45 mRNA水平較生理組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸1組和艾灸2組海馬區(qū)SOD2、GADD45水平較生理組低,較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸1組與艾灸2組海馬區(qū)SOD2、GADD45水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);非穴位組海馬SOD2、GADD45水平較生理組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);非穴位組海馬區(qū)SOD2水平較艾灸2組及非穴位組海馬區(qū)GADD45水平較艾灸1組與艾灸2組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。模型組大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45 mRNA水平較生理組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸 1組、艾灸 2組大腦皮質(zhì)SOD2 mRNA水平較生理組低下,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而艾灸1組、艾灸2組大腦皮質(zhì)GADD45 mRNA水平與生理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);艾灸1組、艾灸2組大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45水平較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艾灸1組與艾灸2組大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45水平組比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);非穴位組大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45水平較生理組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);非穴位組大腦皮質(zhì) SOD2水平較艾灸 1組及非穴位組大腦皮質(zhì)GADD45水平較艾灸1組與艾灸2組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 益髓灸對(duì)小鼠海馬及大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45 mRNA水平的影響 (x±s)

3 討論

目前認(rèn)為 D-半乳糖誘導(dǎo)的模型動(dòng)物壽命縮短是由氧化應(yīng)激所致,引起線粒體、神經(jīng)損傷,進(jìn)一步表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降[7]。SOD2,即錳超氧化歧化酶,主要分布在線粒體,是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化蛋白,能夠減少超氧陰離子等超氧化物,是細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激的主要作用機(jī)制。SOD2能夠通過減少超氧化物的生成,減輕腦組織損傷,同時(shí)通過抑制線粒體內(nèi)部細(xì)胞色素 C向胞漿轉(zhuǎn)移,從而抑制線粒體依賴性細(xì)胞死亡信號(hào)通路的激活[8-9]。研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌內(nèi)重組得到SOD2通過介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞,能夠清除細(xì)胞內(nèi)外自由基,從而降低氧化引起的損傷[10-12]。GADD45家族(GADD45a、GADD45b、GADD45γ)具有監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等DNA損傷修復(fù)的功能[13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抗氧化過程是通過 GADD45等級(jí)聯(lián)的相互作用而實(shí)現(xiàn)的,細(xì)胞周期G0/G1期阻滯通過應(yīng)力傳感器激活GADD45基因蛋白,進(jìn)行 DNA損傷監(jiān)測(cè)及修復(fù)[14-15]。且當(dāng) GADD45b缺乏時(shí),G2/2M細(xì)胞周期阻滯,會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的 DNA損傷的增高。張松等[16]發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷經(jīng)DHCA術(shù)后,能夠上調(diào)海馬區(qū) GADD45b,降低腦組織耗氧量,起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。同時(shí)GADD45蛋白可能提供潛在的治療老年相關(guān)疾病的靶點(diǎn)和促進(jìn)長(zhǎng)壽。FOXO基因是一種長(zhǎng)壽基因,FOXO4和FOXO3a轉(zhuǎn)錄因子是GADD45基因的啟動(dòng)子,通過上調(diào)GADD45對(duì)氧化應(yīng)激引起的損傷而促進(jìn)DNA修復(fù),從而影響機(jī)體的壽命[17]。

衰老病位在腦,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為:“腦為髓海”(《靈樞·海論》),“腎不生則髓不能滿”(《素問·逆調(diào)論》),“靈機(jī)記性在腦,因飲食生氣血,……化而為髓,由脊骨上行入腦,又名腦髓”(《醫(yī)林改錯(cuò)》),脾胃為氣血生化之源,髓海有賴脾胃氣血滋養(yǎng),所以提出“脾腎主腦髓”說[18]。元?dú)獠蛔?氣化失常,還造成血瘀、痰濁等,故腦衰老主要病機(jī)變化是脾腎虧虛夾瘀[19]。艾灸具有溫補(bǔ)元?dú)狻⑴嗄I固本的功效,且臨床操作方便簡(jiǎn)易,無不良反應(yīng),在腦衰老的預(yù)防及治療方面均有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[20-23]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究及本課題組前期研究證明,D-半乳糖致衰老小鼠在形態(tài)及生理、生化的許多觀測(cè)指標(biāo)的改變與18月齡自然衰老小鼠相似[24-29]。艾炷灸能夠提高 D-半乳糖致衰老小鼠大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元的密度,減少神經(jīng)元細(xì)胞的變性、壞死,減輕D-半乳糖造成的氧化損傷,降低腦組織NO含量和NOS活力,保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu),延緩腦衰老[30-31]。

有學(xué)者證實(shí)D-半乳糖致衰老小鼠海馬、皮層區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞中相關(guān)RNA、蛋白水平會(huì)下降[3]。足三里為胃經(jīng)的合穴,胃為后天之本,為氣血化生之源,其經(jīng)多氣多血,故足三里具有健脾益胃、強(qiáng)壯機(jī)體的作用;懸鐘乃髓會(huì),膽經(jīng)之穴,主骨所生病,有生髓之功。兩穴合用具有健脾益氣、補(bǔ)益髓海之功,二穴亦為《針灸大成》中治療中風(fēng)、偏枯等腦病的常用穴。關(guān)元穴為足三陰與任脈的交會(huì),元陰元陽交會(huì)之所系,為一身元?dú)庵?具有培補(bǔ)腎元、補(bǔ)益精血的功能,百會(huì)屬督脈,且位于巔頂正中,為髓海之氣轉(zhuǎn)輸之處,有疏通腦絡(luò)、填髓充腦之功效,是治療腦病的主穴。二穴施灸具有補(bǔ)腎培元、填精充髓之功效。故本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上,從“補(bǔ)腎益髓”和“健脾益髓”角度出發(fā)以D-半乳糖衰老小鼠作為模型,通過對(duì)海馬和大腦皮質(zhì)中SOD2、GADD45兩種mRNA、蛋白監(jiān)測(cè),從不同角度來評(píng)估艾灸對(duì)腦衰老的影響。我們的研究結(jié)果顯示,與生理組比較,模型組小鼠海馬和皮質(zhì)中 SOD2、GADD45的mRNA和蛋白水平顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較,艾灸 1組和艾灸 2組海馬、皮質(zhì) SOD2、GADD45的mRNA和蛋白水平明顯升高(P＜0.05)。與非穴位組比較,艾灸1組和艾灸2組海馬區(qū)SOD2、GADD45的mRNA和蛋白水平明顯升高(P＜0.01)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 D-半乳糖致衰小鼠海馬及大腦皮質(zhì)SOD2、GADD45的mRNA和蛋白水平降低,通過艾炷灸的干預(yù)治療可以提高 D-半乳糖衰老小鼠模型大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)SOD2、GADD45的mRNA和蛋白水平。非穴位艾炷灸在一定程度上提高了衰老小鼠腦組織中的抗衰老 mRNA、蛋白,但效果遠(yuǎn)不及艾灸1組、艾灸2組,原因可能是由于艾炷燃燒時(shí)產(chǎn)生物理、化學(xué)因子通過表皮神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的一些生物物理效應(yīng)[32-34]。綜上所述,艾炷灸足三里、懸鐘穴及百會(huì)、關(guān)元穴能夠提高腦組織中SOD2、GADD45的mRNA及蛋白的表達(dá),提高腦組織的抗氧化作用,這可能是延緩衰老的機(jī)制之一;研究結(jié)果顯示“補(bǔ)腎益髓”灸與“健脾益髓”灸兩種療法比較無顯著性差異,在臨床上可輪替或聯(lián)合應(yīng)用,對(duì)防治老年腦病具有一定的積極作用。

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