于季申，李 鵬，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163000）

在集約化中國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)系統(tǒng)疾病呈現(xiàn)傳播速度快、范圍廣的特點。豬消化系統(tǒng)疾病是一種典型的多因素性疾病。近年來，因腹瀉死亡的仔豬占仔豬死亡總數(shù)的38.9%[1]，給養(yǎng)殖場造成較大的經(jīng)濟損失。引起豬消化系統(tǒng)衰竭的病原很多，其中傳染性病原是導(dǎo)致豬群高發(fā)病率和高死亡率的重要原因之一，為了防止疾病的進一步蔓延，需要對病原進行快速、準確的診斷。

豬藍耳?。≒RRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種豬的高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均可發(fā)生，但以妊娠母豬和仔豬最為常見[2]。該病以母豬發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、高死亡率等為主要特征，嚴重危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)。在2006年夏季，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株引起的“高熱綜合征”在我國暴發(fā)，呈現(xiàn)高發(fā)病率和高病死率的特點，成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的新疫病之一，我國將其稱為“高致病性豬藍耳病”，列入一類動物疫病[3]，且深得各大養(yǎng)豬戶日益關(guān)注。

大腸桿菌?。‥.coli）是指由致病性大腸桿菌引起多種動物不同疾病或病型的統(tǒng)稱，主要分為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫3種。包括動物的局部性或全身性大腸桿菌感染、大腸桿菌腹瀉、敗血癥和毒血癥等[4]。豬感染致病性大腸桿菌時主要分為早發(fā)性大腸桿菌病和遲發(fā)性大腸桿菌病2種，即仔豬黃痢和仔豬白痢。仔豬黃痢可造成仔豬排黃白色水樣便，體重減輕甚至死亡；仔豬白痢主要以排灰白色的糞便為主，呈漿糊狀，有腥臭味[5]。致病性大腸桿菌主要存在于母豬的腸道、產(chǎn)道及周圍環(huán)境中，因此帶菌母豬是本病的主要傳染源。豬的各種大腸桿菌病主要通過消化道感染。仔豬黃痢最容易發(fā)生于1～3日齡的仔豬，但個別仔豬也可能在生后12 h內(nèi)發(fā)病，往往在同窩仔豬中的發(fā)病率達80%以上，病死率較高。仔豬白痢多發(fā)生于10～30日齡的仔豬，如果一窩仔豬有1頭發(fā)病，其余仔豬便可同時或相繼發(fā)生，發(fā)病率中等，病死率低，豬水腫病主要發(fā)生于斷奶后1～2周的仔豬，并且病豬絕大多數(shù)是生長快而肥壯的仔豬，其發(fā)病率雖低，病死率可達90%以上[6]。

本試驗根據(jù)對大慶安達市某豬場送檢豬的流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢和實驗室診斷，確診其發(fā)病原因是該豬群同時感染豬高致病性藍耳病毒和大腸桿菌，該豬場飼養(yǎng)管理水平低，飼養(yǎng)密度大，飼料驟變；環(huán)境消毒不合格，排泄物沒有無害化處理，沒有經(jīng)過科學(xué)的疫苗免疫程序，這些因素給病原提供大量繁殖并發(fā)生變異的機會，造成多種病原存在豬只體內(nèi)，當(dāng)環(huán)境驟變、天氣寒冷、豬體抵抗力下降時，造成大腸桿菌與豬藍耳病毒混合感染，該豬場防治措施不完善，可能多次診斷失誤沒有對癥下藥來治療，所以必要時要進行實驗室診斷來確保萬無一失，現(xiàn)將診斷過程總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 大慶安達市地區(qū)某豬場送檢的病死仔豬，實驗室無菌采集豬的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟和腸，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗材料DL 2000 DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬瘟病毒（HC）、高致病性豬藍耳?。≒RRS）、豬普通致病性豬藍耳?。≒RRS）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬偽狂犬病毒（PR）、豬細小病毒（PP）、豬流行性腹瀉（PED）、豬傳染性胃腸炎（TGE）的基因序列計特異引物。

1.4 細菌分離培養(yǎng) 無菌剪取一小塊深部組織臟器，接種涂抹于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上，分別做需氧和厭氧培養(yǎng)，置37℃恒溫箱中24 h，同時用接菌環(huán)挑取腸內(nèi)容物接種在伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血情況等，挑取疑似菌的單個菌落進行純培養(yǎng)。

1.5 核酸的提取與PCR鑒定

1.5.1 組織DNA和RNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit操作進行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒進行提取RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增 按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA在-20℃進行保存?zhèn)溆谩Ｓ玫玫降腄NA和cDNA為模板，豬瘟病毒（HC）、高致病性豬藍耳?。≒RRS）等特異性引物進行PCR反應(yīng)擴增，取10 μL的擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 藥敏試驗 將上述分離到的病原菌接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片（慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星等10種藥物）分別貼于平皿中，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，抑菌環(huán)直徑＜15 mm為低度敏感；≥15 mm為高度敏感。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 病理變化 病豬在臨死前1周表現(xiàn)為嚴重的腹式呼吸，眼瞼水腫及腹瀉，耳間至耳根皮膚發(fā)紺；病豬也出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀，如肌肉震顫、呆立或運動失調(diào)、后軀麻痹，逐日消瘦，精神萎靡不振，尸體表面有紅紫色瘢痕，臀部較為嚴重。剖檢可見剖檢病死豬淋巴結(jié)都有不同程度淤血、出血、腫脹等癥狀，切面濕潤多汁；脾呈暗紫色，輕度腫脹。腎臟腫大顏色黑紫色、可見腎臟布滿大小不一的、彌漫型的出血點臟、肝臟腫大，胸包有大量積液。尸體嚴重脫水，胃腸道膨脹、有多量黃色液體內(nèi)容物和氣體，腸黏膜有卡他性炎癥病變。

圖1 耳間至耳根皮膚發(fā)紺Fig.1 Ear to ear skin cyanosis

圖2 眼瞼水腫、肌肉震顫Fig.2 Blepharoedema,muscle tremor

圖3 尸體嚴重脫水、消瘦、表面紅紫色瘢痕，臀部較為嚴重Fig.3 The body is severely dehydrated,emaciated,red and purple cicatricial,and the hips are more seriouseffusion

圖4 腎臟腫大顏色黑紫色Fig.4 Kidney swollen color and black purple

圖5 病死豬淋巴結(jié)不同程度出血、淤血、腫脹Fig.5 Different degrees of bleeding,congestion and swelling of the dead pig's lymph nodes

圖6 胃腸道膨脹，有少量鼓氣Fig.6 Swelling of the gastrointestinal tract with a small amount of drums

2.2 涂片染色特性 將病料中所分離的細菌進行純培養(yǎng)，進行革蘭氏染色、涂片、鏡檢?？梢姷礁锾m氏染色陰性桿菌，中等大小，直桿菌（見圖7）。由于大腸桿菌和沙門氏菌的形態(tài)及染色特征十分相似，所以為了區(qū)分這兩種細菌，又分別接種于伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng)，結(jié)果為麥康凱培養(yǎng)基長出粉色，光滑，圓形菌落；在伊紅美藍培養(yǎng)基長出紫黑色，金屬光澤菌落（見圖8和圖9）。

圖7 革蘭氏染色兩端鈍圓桿狀菌（10×10）Fig.7 Gram staining at both ends of blunt rod-shaped baculovirus

圖8 伊紅美藍培養(yǎng)基 菌落金屬光澤Fig.8 Eosin methylene blue medium colony metallic luster

圖9 麥康凱培養(yǎng)基 圓形菌落粉色、光滑F(xiàn)ig.9 Makanke culture base round colony pink and smooth

2.3 PCR檢測結(jié)果 以組織中提取的病毒DNA以及病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別選用豬瘟病毒（HC）、高致病性豬藍耳?。≒RRS）、豬普通致病性豬藍耳?。≒RRS）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬偽狂犬病毒（PR）、豬細小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉（PED）、豬傳染性胃腸炎（TGE）的特異性引物進行PCR鑒定。第1孔豬瘟病毒與第6孔豬細小病毒分別出現(xiàn)在非特異性條帶中，原因是倆個病毒分別呈現(xiàn)陰性，不呈陽性結(jié)果不成立，所以倆個病毒除外，其中第2孔在420bp左右有一條條帶，與豬高致病性藍耳病毒預(yù)期片段大小相符如圖10）。

圖10 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.10 PCR electrophoresis analysis chart

2.4 藥敏試驗結(jié)果

表2 藥敏結(jié)果Table 2 The results of drug susceptibility

3 討論

3.1 發(fā)病原因 對該豬場豬群的發(fā)病原因進行調(diào)查：該牛場飼養(yǎng)管理水平低，不衛(wèi)生，飼養(yǎng)密度大，飼料混雜；環(huán)境消毒不合格，排泄物沒有無害化處理；沒有在特定時間內(nèi)進行免疫，這些因素給病原提供大量繁殖并發(fā)生變異的機會，當(dāng)環(huán)境驟變時，牛體抵抗力下降，病原侵入牛體內(nèi)仍然沒有及時送檢治療，給豬場帶來巨大的經(jīng)濟損失,通過本試驗細菌分離鑒定、PCR診斷、藥敏試驗高度加深了診斷結(jié)果的準確性和真實性，可以對癥下藥緊急采取治療措施，以防誤診漏診，確保萬無一失。

3.2 防治措施

3.2.1 加強豬場管理 病死豬要進行無害化處理，被污染的圈舍、器具要進行消毒，糞便要進行堆積發(fā)酵處理，保持豬舍通風(fēng)、干燥。在多數(shù)豬場尚無多點生產(chǎn)體系情況下，保育舍和育肥舍要作到單元式全進全出生產(chǎn)管理，即每個牛舍的用具、人員等要獨立，用具不可共用，人員不要來往[7]。要加強護理，一旦發(fā)現(xiàn)病牛最好隔離，單獨飼養(yǎng)，給其創(chuàng)造一個安靜舒適的環(huán)境，減少應(yīng)激，有利于疾病的康復(fù)。

3.2.2 全面消毒 豬場環(huán)境要經(jīng)常消毒，疫情嚴重威脅時，每天消毒1次，連續(xù)消毒1周，以后夏天2次/周，冬天1次/周。

3.2.3 緊急措施 發(fā)病豬應(yīng)立即隔離，病情較重病豬果斷淘汰，對病死豬采用深埋處理。糞便作為重要傳播源應(yīng)進行發(fā)酵或深埋處理，豬舍和工具應(yīng)及時清洗并消毒，

3.2.4 對癥治療 對于腹瀉較嚴重的仔豬還可服用神經(jīng)性止瀉藥阿托品[8-9]。對于無明顯癥狀的豬進行緊急豬藍耳疫苗接種[10]。

4 結(jié)論

通過對該病死豬的病理解剖、實驗室診斷和豬場全規(guī)模調(diào)查，確診送檢的病死豬死亡原因是該豬感染了大腸桿菌和豬藍耳病病毒，引起豬群混合感染，并非偶然，發(fā)生主要原因是該豬場環(huán)境衛(wèi)生偏差，沒有科學(xué)免疫措施，糞便沒有及時處理，環(huán)境溫差驟變，豬群抵抗力下降，造成繼發(fā)混合感染。

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