周晨陽

（遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽110164）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRSV感染引起的以妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡段豬呼吸道疾病為主要特征的病毒性傳染病[1-2]，在我國，該病俗稱“豬藍(lán)耳病”，該病呈全球性分布，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。20世紀(jì)80年代末，該病最先在美國暴發(fā)，引起豬群發(fā)生“流產(chǎn)風(fēng)暴”，因?yàn)楫?dāng)時(shí)病因不明，該病被稱為“神秘豬病”，1991年荷蘭學(xué)者首次分離到該病的病原，確定為一種新型的RNA病毒[3]，1992年正式將該病統(tǒng)一命名為“豬繁殖與呼吸綜合征”。我國于1996年首次發(fā)現(xiàn)該病并分離到病毒[4]，隨后該病在我國迅速傳播并廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV主要感染單核細(xì)胞和完全分化的豬肺泡巨噬細(xì)胞[5]，健康豬感染PRRSV后，2～14周內(nèi)都會向外排毒，易感豬可通過口、鼻腔、藥物注射等多種途徑感染病毒，懷孕母豬感染后妊娠后期流產(chǎn)率達(dá)50%～70%，仔豬死亡率至少達(dá)35%[6]。因此，該病是養(yǎng)豬業(yè)威脅最大的傳染病之一。

副豬嗜血桿菌病由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuisis，Hps）引起，以多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為主要特征，該病也被稱為豬革拉澤氏病（Glsser′s disease）[7-8]。Hps屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧菌，細(xì)菌形態(tài)呈現(xiàn)出多形性桿狀，該菌生長需要依賴NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時(shí)會出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。該菌體外培養(yǎng)條件極為苛刻，首次分離最好在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中還需加入5%的血清和0.01%的NAD。正因如此，該菌的分率小于檢出率。該病通常情況下常與病毒病混合感染，例如藍(lán)耳病、豬瘟、豬偽狂犬等。當(dāng)免疫力低下時(shí)，該病就會爆發(fā)。目前，根據(jù)血清學(xué)分型，該菌一共有1～15個(gè)血清型，其中1、5、10、12、13、14為強(qiáng)度株；2、4、8、15為中毒株；其余為弱毒株。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查我國流行株為4、5、13型，該病的發(fā)病率為10%～15%，但死亡率可達(dá)50%[9]。因此，Hps也是豬細(xì)菌病之中威脅最大的疾病之一。

2017年10月份，遼寧地區(qū)遼陽市某豬場斷奶仔豬出現(xiàn)體溫升高，呼吸困難，被毛松亂，仔豬大量死亡，個(gè)別仔豬耳朵發(fā)紫，關(guān)節(jié)腫大。對仔豬剖檢發(fā)現(xiàn)，胸腔積液，肺臟條帶狀或點(diǎn)狀出血、間質(zhì)增寬，有大量纖維素性滲出，個(gè)別豬胸膜與肺粘連，絨毛心，腹腔見纖維素性滲出，腸管由纖維素性滲出物黏成一團(tuán)，關(guān)節(jié)液增多、混濁。從臨床癥狀和剖檢變化看，懷疑豬繁殖與呼吸綜合征同副豬嗜血桿菌混合感染。無菌采集病料后，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗(yàn)鑒定、PCR檢測，最終確定為經(jīng)典豬藍(lán)耳病和副豬嗜血桿菌病混合感染。

1 材料與方法

1.1 病料采集 無菌采集新鮮的肺臟、心臟、淋巴節(jié)及關(guān)節(jié)液病料，供實(shí)驗(yàn)室診斷使用。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和優(yōu)級胎牛血清購自于北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于大連寶生物科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix購自于北京艾德萊生物科技有限公司；TriZol up、DNA Marker DL 2000均購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、吲哚、果糖等生化管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物 經(jīng)典豬藍(lán)耳病引物參照高琦等[10]使用的引物進(jìn)行合成；副豬嗜血桿菌引物使用該菌特定的16SrRNA序列擴(kuò)增引物，序列如表1，引物由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物Table 1 Primer

1.4 病料處理 將肺臟、心臟、淋巴結(jié)各取0.1 g，一起放入滅菌研缽中，每次加入適當(dāng)液氮，將病料碾磨成粉，取適當(dāng)病料粉末（約0.1 g）裝入1.5 mL除酶離心管中，加入1 mL TriZol up，用槍反復(fù)抽吸，室溫放置5 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫孵育3 min；10 000 r/min 4℃離心15 min；吸取上層透明液體400 μL放入已預(yù)冷的1.5 mL除酶離心管中，加入500 μL預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育10 min；10 000 r/min 4℃ 離心10 min，將上清液全部棄掉；加入1 mL預(yù)冷的75%的乙醇，漩渦震蕩；7 500 r/min，4℃離心10 min；棄上清，室溫晾干管內(nèi)乙醇；加入50 μL RNA溶解液；55℃孵育10 min。保存-70℃保存。

1.5 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進(jìn)行PRRSV核酸反轉(zhuǎn)錄操作。

1.6 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將無菌采集的新鮮病料立刻帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離，在超凈工作臺中利用無菌手術(shù)刀將肺臟、心臟切開，取適當(dāng)大小的深層組織平板涂布于TSA培養(yǎng)基中，每個(gè)組織涂布3個(gè)平皿。吸取100 μL關(guān)節(jié)液直接涂布在TSA培養(yǎng)基中，做3個(gè)重復(fù)。接完平皿后放入5%的CO2培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng)18 h。

1.7 菌落形態(tài)觀察及革蘭氏染色 將生長出來的菌落進(jìn)行觀察，查看是否有與副豬嗜血桿菌相似的菌落，正常副豬嗜血桿菌的菌落直徑約為1 mm左右，液滴狀，半透明，邊緣整齊。挑取單個(gè)菌落放入200 μL滅菌離心管中，加入10 μL生理鹽水，混合均勻。吸取2 μL菌液進(jìn)行革蘭氏染色；結(jié)晶紫1 min，碘液1 min，95%酒精40 s，石炭酸復(fù)紅1 min。

1.8 生化鑒定 將疑似菌落繼續(xù)劃線培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落接入生化試劑管中，每個(gè)生化試管中加入5 μL的0.01%NAD，37℃培養(yǎng)12 h。

1.9 細(xì)菌基因組DNA提取 用2 mL滅菌蒸餾水將TSA平皿中細(xì)菌洗下，5 000 r/min離心5 min，去上清，再加入200 μL滅菌蒸餾水，混勻后100℃煮沸10 min，立即放入-20℃冷凍10 min，取出融后，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為模板DNA。

1.10 PCR鑒定 豬藍(lán)耳病和副豬嗜血桿菌PCR反應(yīng)體系為（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上游引物、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。經(jīng)典藍(lán)耳病PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2 min；94℃，30 s，54℃，30 s，72℃，30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。副豬嗜血桿菌PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，3 min；94℃，30 s，59℃，30 s，72℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。擴(kuò)增結(jié)束后各取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.11 藥敏試驗(yàn) 將分離出來的副豬嗜血桿菌在TSA平皿中均勻涂布，正置30 min后，貼入藥敏試紙片（頭孢呋辛、卡那霉素、青霉素等10種藥物）。37℃倒置培養(yǎng)16 h后，測量抑菌圈大小，根據(jù)結(jié)果判定敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化 剖檢病豬發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)腫大充血，胸腔積液增多，肺臟肉樣變，心包膜增厚，心包液增多，病豬脾臟腫大、淤血、邊緣壞死，顏色呈暗紅色，肝臟和腸道有明顯的出血點(diǎn)。切開關(guān)節(jié)后發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)積液，內(nèi)有干酪樣物質(zhì)，如圖1（A-D）。

圖1 剖檢變化Fig.1 Clinical symptoms

圖2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Fig.2 Bacteria isolation and identification results

2.2細(xì)菌分離及革蘭氏染色結(jié)果 將生長出邊緣整齊、半透明、液滴狀、直徑約為1 mm的菌落挑出繼續(xù)劃線增菌（如圖2-A）。革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌，形態(tài)為長短不一、無芽孢、不規(guī)則排列桿狀（如圖2-B）。

2.3 生化鑒定結(jié)果 將培養(yǎng)的細(xì)菌接入以下生化試劑管，37℃培養(yǎng)12 h后觀察變化，結(jié)果與副豬嗜血桿菌生化特性相符，如表2。

表2 生化試驗(yàn)Table 2 biochemical tests

2.4 PCR結(jié)果PCR鑒定結(jié)果表明，經(jīng)典豬藍(lán)耳病病毒和副豬嗜血桿菌在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶，并且陰性對照未出現(xiàn)條帶，如圖3。

圖3 PCR電泳分析圖Fig.3 PCR electrophoresis analysis chart

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 觀察抑菌圈直徑大小，參考劉麗穎等[11]判定副豬嗜血桿菌對抗生素是否耐藥性。判斷標(biāo)準(zhǔn)為抑菌圈直徑小于20 mm為不敏感，20～30 mm為中度敏感，30 mm以上為高度敏感，結(jié)果見表3。

表3 藥敏結(jié)果Table 3 The results of drug susceptibility

3 討論

本試驗(yàn)通過對發(fā)病死亡仔豬進(jìn)行剖檢，根據(jù)發(fā)病死亡豬臨床癥狀、病理變化，結(jié)合采集的新鮮病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，最終鑒定出該例病例為經(jīng)典豬藍(lán)耳病與副豬嗜血桿菌病混合感染。進(jìn)一步對該場的免疫情況以及飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該場的免疫水平較低，飼養(yǎng)環(huán)境條件較差，通風(fēng)不好，并且飼養(yǎng)密度大，潮濕，糞便清理不及時(shí)。飼料堆積處通風(fēng)條件差，這些可能是造成了該場疫病發(fā)生的主要原因。因此該場應(yīng)及時(shí)做好豬藍(lán)耳病等相關(guān)疫病免疫接種，改善飼養(yǎng)環(huán)境。副豬嗜血桿菌屬于豬體內(nèi)常在菌，當(dāng)豬免疫力低下時(shí)，中等毒力、強(qiáng)毒株就會產(chǎn)生致病作用。該病發(fā)病呈現(xiàn)出季節(jié)性，一般秋冬季高發(fā)。經(jīng)常和其他病原體混合感染，例如與豬繁殖和呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬呼吸道冠狀病毒、鏈球菌、支原體等[12]。本研究通過PCR檢測、細(xì)菌分離及生化試驗(yàn)鑒定到導(dǎo)致該例發(fā)病豬死亡的病原包含副豬嗜血桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離鑒定的副豬嗜血桿菌對頭孢噻呋、羧芐西林、頭孢唑啉、氟苯尼考高度敏感；對洛美沙星、慶大霉素、氧氟沙星、新霉素、環(huán)丙沙星中毒敏感；對林可霉素不敏感。該結(jié)果為防治本豬場的副豬嗜血桿菌提供科學(xué)用藥依據(jù)。目前，防控豬藍(lán)耳病和副豬嗜血桿菌病的有效手段還是有針對性接種流行病毒株和菌株血清型相匹配的疫苗，定期監(jiān)測抗體水平，合理制定免疫程序，并結(jié)合健全的生物安全綜合措施，因此，建議飼養(yǎng)場根據(jù)診斷結(jié)果，合理選擇疫苗、定期開展相關(guān)監(jiān)測、科學(xué)制定免疫程序，并注重飼養(yǎng)環(huán)境的生物安全。

4 結(jié)論

通過臨床癥狀，病理解剖，實(shí)驗(yàn)室診斷確定該豬場發(fā)生了經(jīng)典豬藍(lán)耳病及副豬嗜血桿菌病混合感染。

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