， ， ，2，，2，，2

副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus，Vp)屬于弧菌科弧菌屬，是一種嗜鹽性細菌，革蘭氏染色為陰性。Vp是最重要的食源性致病菌之一，據(jù)國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示近年來由副溶血弧菌引起的食物中毒居微生物食源性疾病之首[1]。溶血素是副溶血性弧菌的重要毒力因子，是一種胞外產(chǎn)物，起溶解紅細胞的作用。其中耐熱溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、耐熱相關溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐熱溶血素(thermoliable hemolsin，TLH)是主要致病因子，分別由tdh、trh、tlh基因編碼。其中，tlh基因具有種屬特異性，在臨床分離株和環(huán)境分離株中都存在[2]，雖然環(huán)境分離株神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon，KP)較少見，但只要攜帶tdh或trh基因就可被認為是毒力株[3]。1996年起以O3∶K6血清型為代表的大流行株[4]在全球流行，其具有相同的基因型(tdh陽性，trh陰性，尿素酶陰性)，orf8是噬菌體f237 10個開放閱讀框(open reading frame，ORF)中獨特的一個，與O3∶K6血清型菌株大流行有關[5]，在超過96%的大流行株中存在。

隨著抗菌藥物在臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不合理使用，導致副溶血性弧菌的耐藥程度日趨嚴重[6]。當耐藥菌通過食物鏈傳遞到人類，將會導致臨床用藥的失效，從而嚴重威脅人類的健康。細菌抗藥性產(chǎn)生的機制復雜而多樣，目前研究的主要有靶位基因突變、外排泵作用及可移動基因元件等方面。其中由外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)介導耐藥性的產(chǎn)生是重要機制之一，包括外膜通透性的降低[7]和主動外排[8]兩種機制。本研究對江蘇省部分地區(qū)的副溶血性弧菌分離株進行了分子鑒定，包括毒力基因、大流行株標識基因及本實驗室發(fā)現(xiàn)的推定外膜蛋白編碼基因，測定了對8種常見抗生素的耐藥性情況，并重點分析了VPA0166(編碼推測外膜蛋白)的分子多樣性與基因特征、耐藥性的相關性，為尋找副溶血性弧菌的耐藥機制提供重要線索，加強了對菌群的了解，有利于抗菌藥物的合理使用和新藥的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 副溶性弧菌標準菌株ATCC 33847(tdh+trh-)、大腸桿菌標準菌株ATCC 25922均由本實驗室保存；166株副溶血弧菌菌株分離收集于2006-2014年江蘇省部分地區(qū)海產(chǎn)品、熟食、醫(yī)院肛拭子等不同來源，經(jīng)VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定為副溶血性弧菌。

TCBS瓊脂、M-H瓊脂和3% NaCl堿性蛋白胨水 北京陸橋技術有限公司；8種抗生素藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司；PCR反應試劑 寶生物工程(大連)有限公司。

1.2儀器與設備 瑞士Kuhner Shaker公司ISF1-XC型恒溫振蕩培養(yǎng)箱；美國ABI公司Veriti PCR擴增儀；美國BIO-RAD公司Model 3000Xi型電泳儀；美國BIO-RAD公司GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1引物設計與合成 本研究選擇種特異性基因不耐熱溶血素(tlh)[2]鑒定副溶血性弧菌，vpa0166-1引物序列根據(jù)GenBank已發(fā)表的V.parahaemolyticusRIMD 2210633全基因組(登錄號：BA000032.2)序列自行設計，另外，根據(jù)后期測序比對結果優(yōu)化設計更小目的片段引物vpa0166-2。對毒力基因耐熱溶血素(tdh)[9]、耐熱相關溶血素(trh)[10]及大流行株標識基因(orf8)[5]進行檢測，所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。具體引物序列如表1所示。

表1 副溶血性弧菌PCR檢測引物序列

Tab.1 Oligonucleotide primers for PCR

PrimerTarget geneSequence (5′-3′)Amplicon size/bptlh-FatlhAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450tlh-RbGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCVPA0166-1-Favpa0166-1ATGAAAATGAAAACTCTAGC1 050VPA0166-1-RbTTAGAAGTAGTAACGAGCGCVPA0166-2-Favpa0166-2AAYCTRGGTACTGGTCGTGC262VPA0166-2-RbTCTYAACATCACCGCCRCTGtdh-FatdhAGCTTCCATCTGTCCCTTTT434tdh-RbATTACCACTACCACTCTCATAtrh-FatrhGGCTCAAAATGGTTAAGCG250trh-RbCATTTCCGCTCTCATATGCorf8-Faorf8GTTCGCATACAGTTGAGG746orf8-RbAAGTACAGCAGGAGTGAG

注：a，上游引物；b，下游引物。

1.3.2PCR擴增 采用熱裂解法粗提DNA：取新鮮培養(yǎng)物5 000 r/min離心5 min，用雙蒸水洗滌菌體2次，棄上清，加500 μL雙蒸水重懸菌體，100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min離心10 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

tlh、tdh、trh、orf8基因PCR反應體系和擴增程序參考相應文獻[2, 5, 9-10]進行PCR擴增；vpa0166基因PCR反應體積為25 μL，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30循環(huán)；最后72 ℃再延伸7 min，反應結束。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳成像，拍照記錄結果。

1.3.3vpa0166基因擴增產(chǎn)物測序 將PCR反應產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將測序結果用BLAST、BioEdit等軟件參照GenBank(http://www. ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的V.parahaemolyticusRIMD 2210633 chromosome 2全基因組(登錄號：BA000032.2)中相應序列比對分析。

1.4藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準協(xié)會CLSI推薦[11]的紙片擴散法(Kirby-Bauer)測定菌株對8種抗生素的敏感性。挑取TCBS平板上培養(yǎng)18-24 h的單菌落接種3% NaCl堿性蛋白胨水，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h，以無菌生理鹽水調節(jié)菌液濃度至0.5麥氏濃度(OD625=0.08～0.13，約含1～2×108CFU/mL)。取100 μL菌懸液涂布于直徑90 mm，厚度4 mm的M-H瓊脂平板(約25 mL)上，靜置15 min后用滅菌鑷子把藥敏紙片平貼，并輕壓紙片使其與培養(yǎng)基緊貼不掉落，平皿邊緣距離紙片中心應大于15 mm，紙片之間的間距應大于24 mm，每種抗生素貼3個藥敏紙片。37 ℃培養(yǎng)16～18 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑，同時以大腸桿菌ATCC 25922做質控。

1.5相關性分析 采用SPSS 16.0軟件對166株副溶血性弧菌菌株的耐藥性進行統(tǒng)計學分析。

2 結 果

2.1tlh、tdh、trh、orf8和vpa0166基因的PCR檢測結果 按所建立的DNA模板提取方法和PCR方法進行PCR擴增，擴增結果如圖1所示。種特異性引物tlh基因陽性的菌株在450 bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶，166株副溶血性弧菌菌株均出現(xiàn)tlh基因陽性條帶；毒力基因tdh、trh陽性率分別為21.1%(35/166)、9.6%(16/166)，大多分布于臨床株；大流行株標識基因orf8檢出率為17.5%(29/166)，且orf8+菌株都為tdh+；編碼推測外膜蛋白基因vpa0166均為陽性，從電泳圖上可以看出該基因結果具有多樣性，呈現(xiàn)a型和b型兩個形態(tài)，有86株是a型陽性，80株是b型陽性。

注：M，DL2000 DNA Marker；N，陰性對照；1～5，副溶血性弧菌分離株圖1 副溶血性弧菌菌株tlh、tdh、trh、orf8和vpa0166基因的PCR檢測結果Fig.1 Detection of tlh, tdh, trh, orf8 and vpa0166 gene of V. parahaemolyticus isolates by PCR

圖2 vpa0166基因a型和b型擴增產(chǎn)物測序結果Fig.2 Sequencing result of type a and b amplified products of vpa0166

2.2vpa0166基因測序結果分析 通過測序結果與GenBank中已報道的序列對比分析發(fā)現(xiàn)，a型和b型序列同源性為94%，其中a型產(chǎn)物中在523至580 bp之間有54個堿基缺失，見圖2。b型序列與GenBank中登錄的BA000032.2相應序列同源性為99%，表明b型菌株與測序菌株在進化上更接近。毒力基因與vpa0166多樣性相關性分析發(fā)現(xiàn)，vpa0166多樣性與毒力基因的攜帶沒有顯著的相關性，但是tdh+trh-orf8+菌株均屬于b型，大部分tdh-trh+orf8-菌株屬于a型。

2.3藥敏試驗結果 用8種常見抗生素對166株副溶血性弧菌菌株進行藥敏試驗，總體耐藥情況見表2。結果顯示對頭孢西丁和四環(huán)素耐藥率為3%(5/166)，頭孢噻肟、慶大霉素和復方新諾明耐藥率分別為3.6%(6/166)、5.4%(9/166)、1.8%(3/166)。多重耐藥分析結果顯示多重耐藥現(xiàn)象不突出，僅有5株耐2種抗生素以及3株耐3種抗生素，其中有1株菌株對四環(huán)素和復方新諾明同時完全耐藥(藥敏試驗無抑菌圈)，該菌株基因型為tdh-trh-orf8-，分離自無錫市。對同類抗生素的耐藥性有很大不同，如喹諾酮類的環(huán)丙沙星和萘啶酸敏感率分別為51.8%(86/166)、100%(166/166)；β-內酰胺類的頭孢西丁和頭孢噻肟敏感率分別為6%(10/166)、81.9%(136/166)，所有菌株對氯霉素均敏感。

表2 166株副溶血性弧菌藥敏試驗結果

Tab.2 Drug resistance of V. parahaemolyticus strains

DrugSensitive% Intermediarysensitive%Resistant%QuinolonesCiprofloxacin8651.88048.200Nalidixic acid1661000000β-lactamsCefoxitin1061519153Cefotaxime13681.92414.563.6AminoglycosidesGentamicin1519163.695.4ChloramphenicolsChloramphenicol1661000000TetracyclinesTetracycline15090.4116.653SulfonamidesSulphamethoxazole/tri-methoprim 19:11619721.231.8

2.4耐藥性與vpa0166基因型相關性分析 2006-2014年菌株對環(huán)丙沙星的耐藥性未出現(xiàn)明顯波動，中敏感率在32.3%～53.6%之間。不同來源株耐藥分析顯示，臨床株和環(huán)境株對環(huán)丙沙星的中敏感率分別為46.6%(27/58)、49.1%(53/108)。菌株毒力基因攜帶與環(huán)丙沙星的敏感情況無必然聯(lián)系，tdh+trh-/tdh-trh+、tdh-trh-型對環(huán)丙沙星中敏感率分別為56.9%(29/51)、44.3%(51/115)。對8種抗生素的藥敏性與vpa0166多樣性的相關性分析結果如表3所示。結果表明菌株vpa0166多樣性僅對環(huán)丙沙星的敏感率存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，同時有部分a型菌株對環(huán)丙沙星表現(xiàn)中介耐藥，也有部分b型菌株表現(xiàn)為敏感，表明Vp對環(huán)丙沙星耐藥性產(chǎn)生過程中存在其他機制共同作用。

表3 vpa0166基因a型和b型耐藥性比較結果

Tab.3 Comparison result of type a and b drug resistance of vpa0166

Drugvpa0166-type B(n=80)vpa0166-type A(n=86)S(%)I(%)R(%)S(%)I(%)R(%)P valueCiprofloxacin9(11.3)71(88.7)0(0)77(89.5)9(10.5)0(0)<0.05Nalidixic acid76(95)4(5)0(0)83(96.5)3(3.5)0(0)>0.05Cefoxitin3(3.75)74(92.5)3(3.75)7(8.2)77(89.5)2(2.3)>0.05Cefotaxime62(77.5)15(18.75)3(3.75)74(86)9(10.5)3(3.5)>0.05Gentamicin73(91.25)2(2.5)5(6.25)78(90.6)4(4.7)4(4.7)>0.05Chloramphenicol80(100)0(0)0(0)86(100)0(0)0(0)>0.05Tetracycline72(90)5(6.25)3(3.75)78(90.7)6(7)2(2.3)>0.05Sulphamethoxazole/trime-thoprim 19∶176(95)2(2.5)2(2.5)85(98.8)0(0)1(1.2)>0.05

注：S，敏感率；I，中介敏感率；R，耐藥率。

3 討 論

副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus，Vp)是一種重要的食源性致病菌，被認為是典型的海洋性細菌，但也有研究報道發(fā)現(xiàn)在淡水水體中有檢出，Sarkar等[12]通過在印度加爾各答淡水區(qū)域采集的樣品中分離得到副溶血性弧菌。Vp的致病機理較為復雜，目前公認的主要致病因子是耐熱溶血素(TDH)、耐熱相關溶血素(TRH)。本研究表明在所有分離株中，tdh陽性率為21.1%(35/166)，trh陽性率為9.6%(16/166)，未發(fā)現(xiàn)tdh、trh雙陽性高毒力菌株，其中臨床分離株毒力基因攜帶率為63.8%(37/58)遠超過環(huán)境分離株的攜帶率13.0%(14/108)，與國際報道一致[13]，但也有部分區(qū)域環(huán)境、食品分離株毒力基因陽性率也很高[14]。對于環(huán)境株中有毒力基因攜帶，臨床株中存在tdh-trh-型菌株的現(xiàn)象揭示了不同來源副溶血性弧菌分離株的毒力基因呈多態(tài)性分布，并進一步說明的致病過程中存在與TDH或TRH共同作用的其他毒力因子，提示對于TDH和TRH陰性菌株不能忽視其致病性。自1996年O3∶K6大流行株以來，世界范圍內相繼出現(xiàn)許多與O3∶K6有相似遺傳特征的血清型的O3∶K6克隆流行株，導致Vp的感染人數(shù)急劇上升。orf8是f237絲狀噬菌體上的片段，此噬菌體曾被認為是1996年以來大流行株出現(xiàn)的最主要甚至是唯一的原因。本研究中orf8基因檢出率為17.5%(29/166)，且orf8+菌株都為tdh+trh-，有研究表明[15]在Vp進化過程中丟失噬菌體f237部分或全部片段可導致orf8片段的缺失，從而造成假陰性，認為orf8是確定大流行株的充分不必要條件，本研究僅僅將orf8基因作為參考基因研究，未將其作為判定大流行株的唯一標準。

本研究顯示2006～2014年采集的166株Vp分離株未發(fā)現(xiàn)3種以上抗生素多重耐藥的菌株，有1株無錫分離株對四環(huán)素和復方新諾明同時完全耐藥，與李薇薇[16]等發(fā)現(xiàn)的1株浙江分離株耐藥型一樣；對頭孢西丁(第二代頭孢菌素類)、環(huán)丙沙星(第三代喹諾酮類)的中敏感率分別為91%(151/166)、48.2%(80/166)，而黃銳敏[17]等檢測結果顯示對頭孢西丁耐藥率達83.9%，提示這兩種藥物有耐藥趨勢，養(yǎng)殖業(yè)及臨床用藥需引起重視。總體看來，近年來江蘇副溶血性弧菌對大部分抗生素有較好的敏感性，此次頭孢噻肟(第三代頭孢菌素類)的敏感率達81.9%(136/166)，與譚海芳[18]等報道的情況不同，但與秦思[19]等研究結果相吻合，這可能與地區(qū)養(yǎng)殖方式及醫(yī)院用藥習慣不同有關。環(huán)丙沙星耐藥性與毒力基因攜帶、不同來源株相關性分析結果顯示，tdh+trh-/tdh-trh+、tdh-trh-型對環(huán)丙沙星中敏感率分別為56.9%(29/51)、44.3%(51/115)，兩者無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，與呂虹等[20]報道的結果相同，但可適當添加一些毒力調控基因(toxR、toxS)以及毒力相關基因(UreR、FlaA、ompW)等做參考，進一步分析毒力基因分布與耐藥性的相關性。另外，臨床株和環(huán)境株對環(huán)丙沙星的中敏感率分別為46.6%(27/58)、49.1%(53/108)，也無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

vpa0166是位于副溶血性弧菌染色體Ⅱ上的基因，本研究利用生物學軟件PSORTb和PSLpred進行定位分析，確定該蛋白位于外膜，推測其為外膜蛋白。通過PCR方法鑒別出該基因存在兩種基因型(a型和b型)，測序結果表明a型(996 bp)和b型(1 050 bp)序列同源性為94%，且a型較b型產(chǎn)物有54個堿基缺失，與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的V.parahaemolyticusRIMD 2210633的相應蛋白序列同源性比對結果分別為94%和99%，可以看出b型更接近于測序菌株。另外，tdh+trh-orf8+菌株均屬于b型，大部分tdh-trh+orf8-菌株屬于a型，提示vpa0166基因的多樣性為菌株分子分型和分析大流行株的親緣關系提供了靶分子。通過Blasten結果發(fā)現(xiàn)還有24個相關的比對結果，其中有3個關于溶藻性弧菌(Vibrioalginolyticus，Va)也存在兩種型，與RIMD 2210633同源性為86%，而溶藻弧菌與副溶血性弧菌在生物學特性等方面極其相似，同屬于嗜鹽性海生弧菌；另有2個是哈維氏弧菌(Vibrioharveyi，Vh)，但比對結果覆蓋度只有前50%，且相似度只有82%，說明vpa0166基因在弧菌屬(Vibrio)中可被檢測到，而在副溶血性弧菌中分布特性較好。細菌對喹諾酮類耐藥機制的產(chǎn)生主要通過3種方式：靶位改變、膜通透性改變和主動外排。外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)是革蘭氏陰性菌細胞壁特有成分，具有控制小分子如抗生素進出的功能，其介導耐藥性包括外膜通透性的降低和主動外排兩種機制。有研究表明[21]，大腸埃希菌膜孔蛋白OmpF與喹諾酮類藥物抗菌作用有直接關聯(lián)；肺炎克雷伯菌[22]、銅綠假單胞菌[23]中已發(fā)現(xiàn)多種主動外排系統(tǒng)，并已證實其發(fā)揮重要作用。本研究8種抗生素藥敏結果顯示，vpa0166 a型和b型僅對環(huán)丙沙星的敏感率存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其中b型(1 050 bp)更趨于耐藥，a型(996 bp)趨于敏感，表明Vp對環(huán)丙沙星的耐藥性與外膜蛋白編碼基因vpa0166的多樣性存在密切相關，為繼續(xù)研究耐藥機制提供理論依據(jù)。

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