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小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)是一種人獸共患病原菌，感染這種病原體可引起廣泛的臨床表現(xiàn)，如急性腸炎、小腸結(jié)腸炎、末端回腸炎和腸系膜淋巴結(jié)炎，嚴重者還可引發(fā)一系列后遺癥如肝脾膿腫、關節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、耶爾森肝炎和敗血癥等疾病[1]。OmpA是鑲嵌在革蘭陰性菌外膜上的一種產(chǎn)量豐富的β-桶裝蛋白，該蛋白不僅參與生物膜的形成，還可作為噬菌體和細菌素的受體，對于細菌具有重要的生理學功能[2-3]。近年來，越來越多的研究表明OmpA在鼠疫耶爾森菌、沙門菌屬、溶血性曼氏桿菌和鮑曼不動桿菌中都具有良好的免疫原性[4-7]，提示OmpA有可能成為研制這些病原菌疫苗的候選蛋白。本課題組前期研究工作中已發(fā)現(xiàn)ompA核酸序列在三種致病性耶爾森菌中高度保守，并且在25 ℃和37 ℃下均是主要的免疫原性蛋白之一，體外免疫雜交實驗證明該蛋白具有明顯的交叉免疫原性，具備作為致病性耶爾森菌的交叉免疫保護性抗原的潛力[8-10]。本研究使用純化的OmpA蛋白作為免疫原對大鼠進行免疫，通過體內(nèi)實驗對OmpA的免疫保護作用進行分析。

1 材料與方法

1.1實驗菌株和實驗動物 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010(1b/O∶8)和Ye92010-ompA重組克隆子均來自本實驗室。SD雄性大鼠14只，SPF級，體重280～320 g，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部。

1.2主要實驗試劑 His蛋白純化試劑盒購于Novagen公司， BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，IPTG購于Amresco公司，弗氏不完全佐劑購于Sigma公司，細菌基因組提取試劑盒購于Qiagen公司，PBS(pH=7.4)購于Gibco公司，改良増菌液(Peptone Sorbitol Bile Broth)購于Fluka公司，O:8血清型分型血清購自日本生研株式會社，PCR擴增相關試劑購于TaKaRa公司，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3Ye92010-ompA的表達與純化[10]將重組克隆子Ye92010-ompA接種于具kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時加入終濃度1 mmol/L的IPTG，28 ℃培養(yǎng)誘導8 h。使用PBS(pH=7.4)將菌體清洗3次后重懸于binding buffer中，超聲裂解，5 500 r/min 離心10 min收集沉淀。將沉淀溶于含6 mol/L尿素的binding buffer中，冰浴1 h，再轉(zhuǎn)入His層析柱對蛋白進行純化。純化后的蛋白通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色進行驗證，使用BCA蛋白定量試劑盒通過Bradford法對純化后蛋白進行濃度測定。

1.4OmpA免疫保護試驗 實驗動物分組情況見表1，SD大鼠被隨機分為OmpA免疫組(6只)、對照組(6只)和空白對照組(2只)。免疫組使用OmpA純化蛋白與弗氏不完全佐劑混合后(1.5∶1)通過腹股溝注射方式對大鼠進行免疫，對照組由等體積的PBS代替蛋白。首次免疫(0.58 mg/只)后14 d對大鼠進行加強免疫(1 mg/只)。攻毒試驗使用致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010(低劑量組：106CFU、高劑量組：108CFU)通過腹腔注射方式進行。攻毒后開始為期3周的連續(xù)觀察，每日測量大鼠肛溫并采集糞便。

表1 OmpA免疫保護試驗動物分組

Tab.1 Animal grouping of OmpA immunoprotection test

動物分組和攻毒劑量OmpA免疫組對照組空白對照組低劑量攻毒高劑量攻毒低劑量攻毒高劑量攻毒未做任何處理數(shù)量/只33332

1.5糞便排菌實驗及PCR檢測 將大鼠糞便稱重后按1∶2的比例接種于改良增菌液中，置于4 ℃培養(yǎng)7 d后對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進行分離鑒定[11]。分別使用O∶8血清型診斷血清和PCR擴增foxA、ail基因的方法對細菌進行鑒定，引物序列及退火溫度參考文獻[12]。

1.6攻毒后大鼠肝、脾、腸病理切片制作與組織病理變化觀察 攻毒后21d將全部實驗大鼠的肝、脾、回腸末端組織完整取下，觀察其大體形態(tài)。之后，使用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，置于光鏡下觀察組織的病理變化。

1.7統(tǒng)計學分析 應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1OmpA蛋白表達與純化 將Ye92010-ompA重組克隆子表達后，采用His標簽純化柱獲取目的蛋白OmpA，通過SDS-PAGE電泳對所獲取的蛋白進行鑒定，結(jié)果顯示純化后的蛋白約38 kDa(圖1)。與預期結(jié)果相符[10]，BCA法測定目的蛋白濃度為2.01 mg/mL。

M：Marker；泳道1：未誘導的Ye92010-ompA重組克隆子全菌蛋白；泳道2：誘導后Ye92010-ompA重組克隆子全菌蛋白；泳道3：純化的Ye92010-OmpA圖1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌OmpA表達純化SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of purified Ye92010-OmpA

2.2大鼠攻毒試驗 使用Ye92010攻毒4 h后，OmpA免疫組與對照組大鼠均表現(xiàn)出厭食、被毛雜亂、糞便呈松軟非顆粒狀等癥狀，至第2 d有部分恢復、第4 d全部恢復正常。連續(xù)觀察3周，OmpA免疫組和對照組大鼠均未出現(xiàn)死亡，各組大鼠肛溫無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.3糞便排菌檢測 使用Ye92010攻毒后，每日采集大鼠新鮮糞便，通過糞便分離培養(yǎng)和PCR對大鼠糞便排菌情況進行檢測。結(jié)果顯示兩組大鼠糞便排菌起始日均為攻毒后第3 d,其中OmpA免疫組中，經(jīng)低劑量和高劑量攻毒的大鼠糞便排菌時間均為14 d，而對照組中經(jīng)低劑量和高劑量攻毒的大鼠糞便排菌時間分別為17 d和21 d。相對于對照組，OmpA免疫組糞便排菌時間明顯縮短，說明OmpA蛋白免疫原性良好。

2.4攻毒后大鼠肝、脾、腸大體形態(tài)觀察 將攻毒3周后的實驗大鼠進行解剖并觀察各臟器的病理變化。由于Ye92010對大鼠具有較強的致病性，對照組大鼠出現(xiàn)了嚴重的病理改變，可觀察到明顯的組織變性及壞死灶，雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大、肝臟黏連，甚至出現(xiàn)了腸膿腫和重度腸系膜液化等現(xiàn)象(圖2b1-b4)。相比較于對照組，OmpA免疫組大鼠癥狀較輕，僅出現(xiàn)輕度的皮下腫塊或脾腫大現(xiàn)象，腸管間界限模糊，腹股溝淋巴結(jié)腫大也僅局限于單側(cè)(圖2a1-a4)。空白對照組由于未經(jīng)攻毒而無病理學改變(圖2c1-c4)。

注：OmpA免疫組：經(jīng)OmpA免疫后，用Ye92010攻毒的大鼠大體形態(tài)；對照組：等體積PBS代替OmpA免疫后，用Ye92010攻毒的大鼠大體形態(tài)；空白對照組：未經(jīng)任何處理，正常飼養(yǎng)的大鼠大體形態(tài)a1：單側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大；a2：皮下腫塊；a3：輕度脾水腫 a4：腸管間界限模糊；b1：雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大；b2：肝臟黏連；b3：腸膿腫；b4：重度腸系膜液化；c1-c4：正常大鼠大體形態(tài)圖2 各組SD大鼠大體形態(tài)觀察Fig.2 Observation on general morphology of SD rats in each group

2.5細菌攻毒后大鼠肝組織病理學分析 在攻毒試驗中，本研究同時進行高、低菌量的攻毒方案。低劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠肝組織局部可見炎性細胞(淋巴細胞，嗜酸性粒細胞)灶性浸潤，肝組織輕度水腫，細胞胞漿染色變淺(圖3B)；對照組大鼠肝組織局部可見炎性細胞(淋巴細胞，嗜酸性粒細胞)灶性浸潤，肝組織水腫，細胞胞漿染色變淺，肝竇間隙水腫增寬(圖3D)。高劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠肝組織局部可見炎性細胞(淋巴細胞為主)灶性浸潤，肝組織其他結(jié)構(gòu)均正常(圖3C)；對照組大鼠肝組織局部可見炎性細胞(淋巴細胞，嗜酸性粒細胞)灶性浸潤，肝組織水腫，肝竇間隙水腫增寬(圖3E)。

A：正常肝組織；B：低劑量攻毒OmpA免疫組大鼠肝組織；C：高劑量攻毒OmpA免疫組大鼠肝組織；D：低劑量攻毒對照組大鼠肝組織；E：高劑量攻毒對照組大鼠肝組織黑色箭頭所示為炎性細胞灶性浸潤，藍色箭頭所示為細胞胞漿染色變淺，紅色箭頭所示為肝竇間隙水腫增寬圖3 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010攻毒后各組SD大鼠肝組織病理學改變(×200)Fig.3 Histopathologic change of liver of SD rats infected with Ye92010 in each group(×200)

2.6細菌攻毒后大鼠脾組織病理學分析 低劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，脾竇大小正常，脾小結(jié)局部區(qū)域偶見濾泡中心變性壞死(圖4B)；對照組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，紅髓區(qū)域可見較多中性粒細胞散在浸潤，脾竇結(jié)構(gòu)疏松伴輕度擴張和紅髓腫脹，濾泡中心變性壞死(圖4D)。高劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，紅髓區(qū)域可見組織結(jié)構(gòu)疏松、水腫，伴少量中性粒細胞浸潤(圖4C)；對照組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，局部區(qū)域脾臟結(jié)構(gòu)紊亂，脾竇結(jié)構(gòu)疏松伴輕度擴張，紅髓腫脹且局部區(qū)域可見少量中性粒細胞浸潤(圖4E)。

2.7細菌攻毒后大鼠回腸組織病理學分析 低劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠回腸組織粘膜層可見較多炎癥細胞(中性粒細胞，單核細胞，淋巴細胞)散在浸潤，伴有粘膜層及粘膜下層水腫(圖5B)。對照組大鼠回腸組織粘膜層可見大量炎癥細胞(中性粒細胞，單核細胞，淋巴細胞)廣泛浸潤，粘膜下層可見淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)，組織整體水腫(圖5D)。高劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠回腸組織粘膜層局部可見炎癥細胞(淋巴細胞)散在浸潤，伴有組織局部區(qū)域壞死，粘膜下層及肌層結(jié)構(gòu)正常(圖5C)。對照組大鼠回腸組織粘膜層可見大量炎癥細胞(嗜酸性粒細胞，淋巴細胞)廣泛浸潤，粘膜下層組織水腫(圖5E)。

3 討 論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌屬于腸桿菌科，是一種革蘭陰性無芽孢桿菌。在歐洲，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是僅次于空腸彎曲菌和沙門氏菌的第三大人獸共患病病原菌；在我國，已知的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌暴發(fā)感染共2次，總計500多人[13-14]。但由于對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的監(jiān)測起步較晚，很多由該菌感染造成的疾病沒有得到很好的鑒定，故該菌的發(fā)病率在我國一直被嚴重低估，研制對抗致病性耶爾森菌的疫苗對于腸道疾病的預防和控制具有重大意義。近幾年，有大量研究表明OmpA是一種很好的免疫原性蛋白，可作為研制疫苗的候選蛋白。

A：正常脾組織；B：低劑量攻毒OmpA免疫組大鼠脾組織；C：高劑量攻毒OmpA免疫組大鼠脾組織；D：低劑量攻毒對照組大鼠脾組織；E：高劑量攻毒對照組大鼠脾組織黑色箭頭所示為濾泡中心變性壞死，紅色箭頭所示為中性粒細胞浸潤，藍色箭頭所示為紅髓腫脹，黃色箭頭所示為脾臟結(jié)構(gòu)紊亂圖4 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010攻毒后各組SD大鼠脾組織病理學改變(×200)Fig.4 Histopathologic change of spleen of SD rats infected with Ye92010 in each group(×200)

A：正常回腸組織；B：低劑量攻毒OmpA免疫組大鼠回腸組織；C：高劑量攻毒OmpA免疫組大鼠回腸組織； D：低劑量攻毒對照組大鼠回腸組織；E：高劑量攻毒對照組大鼠回腸組織紅色箭頭所示為粘膜層炎癥及水腫，藍色箭頭所示為粘膜下層炎癥及水腫，黃色箭頭所示為淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)圖5 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010攻毒后各組SD大鼠回腸組織病理學改變(×200)Fig.5 Histopathologic change of ileum of SD rats infected with Ye92010 in each group(×200)

OmpA在革蘭陰性菌中廣泛存在，是最主要的外膜蛋白之一。有研究表明該蛋白主要通過粘附于粘膜表面、血清抵抗、侵襲、抗菌肽抵抗和使宿主細胞活化使細菌發(fā)揮致病作用，其高拷貝數(shù)和暴露于細菌表面的特性使其能促發(fā)固有免疫和適應性免疫[15-16]。此外，OmpA可被中性粒細胞彈性蛋白酶特異性識別，并且可誘導實驗動物產(chǎn)生較高水平的抗體，但其對被免疫動物的免疫保護能力目前尚不清楚[17-18]。

在本課題組前期工作中已經(jīng)通過體外實驗，將三種序列性ompA克隆表達蛋白純化后分別免疫小鼠所得的血清與三個型的OmpA進行免疫雜交，結(jié)果證實OmpA良好的交叉免疫原性。因此本研究的目的在于證實OmpA的這種免疫原性是否能給機體帶來免疫保護。本研究通過腹股溝注射的方式對大鼠進行OmpA免疫，攻毒后通過糞便分離培養(yǎng)和PCR鑒定菌株。結(jié)果顯示經(jīng)高劑量攻毒的對照組排菌時間最長，長達21 d，且長于低劑量攻毒對照組。而經(jīng)低劑量和高劑量攻毒的OmpA免疫組排菌時間相同，都在攻毒后14 d檢測不到排菌。排菌實驗結(jié)果表明大鼠經(jīng)OmpA免疫后，Ye92010在腸道的定植受到阻礙并被快速地從腸道清除。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌具有嗜淋巴組織特征，感染小鼠后，在腸粘膜通過M細胞進入下層的淋巴組織，即Peyer結(jié)，這種侵襲可致大量白細胞增生，并與細胞外小腸結(jié)腸炎耶爾森菌形成微小膿腫，還可通過血流或淋巴管播散到肝、脾等臟器，引發(fā)腸以外的其他臟器感染[19-20]。本研究需收集大鼠糞便進行排菌檢測，故并未在急性感染期對大鼠進行組織病理分析，而在其停止排菌后對所有大鼠進行解剖，摘取肝、脾、腸，觀察組織病理學改變，研究致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌OmpA對大鼠的免疫保護作用。大體觀察結(jié)果顯示OmpA免疫組出現(xiàn)腹股溝淋巴結(jié)腫大、皮下腫塊、脾結(jié)節(jié)、輕度腸系膜液化，對照組出現(xiàn)腹股溝淋巴結(jié)腫大、脾結(jié)節(jié)、腸膿腫、脾膿腫、重度腸系膜液化，其中OmpA免疫組中，低劑量攻毒組和高劑量攻毒組各有一只大鼠未觀察到明顯的組織病變及壞死，我們認為可能是由于大鼠個體差異。組織病理切片結(jié)果顯示OmpA免疫組和對照組所有大鼠均出現(xiàn)不同程度的組織病變，肝病變出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和輕度水腫，脾病變出現(xiàn)濾泡中心變性壞死、水腫、炎癥細胞浸潤，腸病變出現(xiàn)粘膜層和粘膜下層炎癥細胞浸潤和水腫。與大體觀察結(jié)果中出現(xiàn)的臟器膿腫、液化較為一致，且均表現(xiàn)為OmpA免疫組的病變程度輕于對照組，說明OmpA對大鼠產(chǎn)生免疫保護。

綜上所述，致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌OmpA免疫大鼠后，可使大鼠抵抗致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的能力大大增強，排菌時間變短，組織病變變輕，OmpA對大鼠的免疫保護作用顯著。本研究表明OmpA不僅在體外水平表現(xiàn)出良好的免疫原性，更能在體內(nèi)水平給機體帶來免疫保護，結(jié)合OmpA在3種致病性耶爾森菌中高度保守的特點，推測OmpA可成為包括鼠疫在內(nèi)的致病性耶爾森菌疫苗的優(yōu)質(zhì)候選蛋白。

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