肖瑞希 陳華國 周欣

貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術工程實驗室，天然藥物質(zhì)量控制中心，貴州 貴陽 550001

摘要：植物多糖因具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性和多種藥用價值，近年已廣泛應用于生命科學等研究領域。由于植物多糖相關研究受其油脂、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)影響較大，故除雜質(zhì)、分離純化技術是該領域研究開展的重要前提。本文對近年來植物多糖的脫脂、除蛋白、除色素等分離純化方法技術的研究現(xiàn)狀進行總結，為植物多糖的深入研究與開發(fā)提供參考。

關鍵詞：植物多糖；除雜質(zhì)；分離純化；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.034

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0136-05

Research Progress in Separation and Purification of Plant Polysaccharides

XIAO Rui-xi， CHEN Hua-guo， ZHOU Xin

Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment， Guizhou Engineering Laboratory for Quality Control&Evaluation; Technology of Medicine， Research Center for Quality Control of Natural Medicine， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China

Abstract： In recent years， because plant polysaccharides are with anti-tumor， anti-virus， anti-ulcer， anti-oxidation and other unique biological activity， a variety of medicinal values have been frequently applied in the field of life sciences research. However， because plant polysaccharides research is limited by its fat， protein， pigment and other impurities， technology of impurities and separation and purification are important premise of research development in this field. This article mainly summarized the recent research on the methods of impurities， separation and purification of plant polysaccharides， which provided a reference for the further research and development of plant polysaccharides.

Keywords： plant polysaccharide； impurity removal； separation and purification； review

多糖廣泛存在于動植物中，它通過超過10個糖苷鍵連接不同或相同的單糖而形成，具有抗腫瘤[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]、抗?jié)僛4]等活性，近年已廣泛應用于生命科學等研究領域。由于植物多糖相關研究受其油脂、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)影響較大，故除雜質(zhì)、分離純化技術是該領域研究開展的重要前提。如何高效低損失地除雜質(zhì)，獲得均一的多糖，越來越受到關注。本文對近年來植物多糖的除雜質(zhì)、分離純化方法的研究現(xiàn)狀進行綜述，為植物多糖的相關研究及進一步開發(fā)利用提供參考。

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31570358）；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項目（黔科合人才[2015]4033）；貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才[2017]5625、黔科合支撐[2018]2826）；貴州省教育廳青年科技人才成長項目（黔教合KY字[2017]123）

通訊作者：周欣，E-mail：alice9800@sina.com

1 多糖除雜質(zhì)

提取后的多糖屬粗多糖，常含有油脂、蛋白質(zhì)、色素、鹽等雜質(zhì)，極大地影響植物多糖結構表征和生物活性分析的后續(xù)工作[5-6]，故除雜質(zhì)對植物多糖研究具有關鍵作用。

1.1 脫脂

植物中含有的少量油脂包裹著多糖使提取液難以滲入原料，阻礙多糖的提取，故在多糖提取之前需要脫脂。目前主要采用一定量的有機溶劑采用索氏回流提取脫脂，常用的有機溶劑為石油醚、乙醚、乙醇。張斌等[7]研究了甘蔗渣多糖提取的最佳脫脂工藝，得出最佳脫脂工藝條件為乙醇和乙醚（9∶1），回流時間4 h，料液比（g∶mL）1∶25，獲得甘蔗渣多糖的提取率為1.02%。

1.2 除蛋白

蛋白質(zhì)與多糖均屬親水性結構復雜的大分子，在除去蛋白質(zhì)的同時多糖也有所損失，因此高效低損失除蛋白的方法越來越受關注。目前，除蛋白的方法主要有Sevage法、三氯乙酸法、酶解法、酶法與化學聯(lián)用法等。

1.2.1 Sevage法

蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中會變性而不溶于水。將植物多糖水溶液與一定配比的氯仿-正丁醇（或戊醇）溶液以5∶1或4∶1比例混合后，劇烈振搖20～30 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠狀，經(jīng)離心可除去變性蛋白。Wang Q Z等[8]采用Sevage法除費菜多糖的蛋白，向樣品中加入Sevage試劑（3∶1），振搖25 min，離心除去蛋白，重復3次，蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率分別為（61.28±0.25）%、（29.16±0.19）%。優(yōu)點：Sevage法條件溫和、操作簡單比較常用。缺點：需重復多次而比較耗時耗財，也不能用于除脂蛋白[9]。

1.2.2 三氯乙酸法

蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團能與三氯乙酸發(fā)生作用造成蛋白質(zhì)變性，相互凝聚沉淀。在多糖水溶液中加入等體積的5%～10%三氯乙酸，混勻靜置過夜，離心除沉淀，重復操作可得到脫蛋白多糖。崔鏨等[10]在冰浴條件下向蘿藦果殼多糖溶液中分組加入一定量的三氯乙酸溶液，使三氯乙酸最終濃度為5%、10%、15%，于4 ℃冰箱中過夜，4000 r/min離心15 min，取上清液。結果顯示，三氯乙酸濃度為10%時，脫蛋白效果最佳，除蛋白率為71.55%。優(yōu)點：能有效去除蛋白。缺點：需靜置過夜耗時；基于酸水解，在一定程度上水解糖苷鍵[11]。

1.2.3 酶解法

蛋白酶可催化水解蛋白質(zhì)，能較溫和地去除蛋白。楊斌等[12]比較了三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法對藍刺頭多糖除蛋白效果，綜合分析顯示優(yōu)化的木瓜蛋白酶法除蛋白效果最佳，除蛋白率、多糖保留率分別為56.57%，98.12%。其最佳工藝為酶解溫度64 ℃，時間2.6 h，pH 6.0。特點：作用溫和，并能較好地保證多糖的生物活性，且多糖損失率較低[9]。

1.2.4 酶法與化學法聯(lián)用法

酶能較為溫和地除蛋白，Sevage法、三氯乙酸法可有效除蛋白，將二者聯(lián)用的方法也較為常用。苗慧琴等[13]比較了酶-三氯乙酸法、酶-Sevage法、酶法、三氯乙酸法、Sevage法對山藥多糖除蛋白的效果。結果表明，胰蛋白酶-三氯乙酸法脫蛋白的效果最好，蛋白脫除率為87.25%，多糖保留率為92.48%，其最佳脫蛋白條件為胰蛋白酶用量0.4 mL、酶解時間45 min、酶解pH 7.5、酶解溫度37 ℃。特點：與單獨使用酶法和化學法相比效率更高，溶劑處理次數(shù)相對減少，試驗耗時短，操作簡單，降低成本[14]。

1.2.5 其他

除了Sevage法、三氯乙酸法、酶法等常用的方法外，還可采用聚酰胺法、高氯酸法、季銨鹽等去除植物多糖蛋白質(zhì)。Yu X H等[11]比較了Sevage法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法、聚酰胺法除西洋參粗多糖的蛋白。結果表明，使用三氯乙酸和聚酰胺獲得的脫蛋白率分別為91.2%和94.9%。然而，三氯乙酸法屬酸水解，在一定程度上水解糖苷鍵，會破壞其性質(zhì)和結構特征。因此，聚酰胺法更適用于多糖溶液脫蛋白，并且多糖損失率僅為10.86%。常飛等[15]比較了Sevage法、三氯乙酸法、Sevage-三氯乙酸法、HClO4法對貴州野生甜藤多糖去蛋白的效果。結果表明，HClO4法脫蛋白效果最佳，經(jīng)3次脫蛋白處理后蛋白脫出率為94.78%，多糖損失率為15.14%。該方法適用于除甜藤植物多糖中的蛋白質(zhì)，工藝簡單，成本低，易于提純，且對環(huán)境友好。Zhou H L等[16]研究用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）去玉米絲多糖蛋白的最佳條件。當NaCl 0.010 g、pH 6.0、CTAB體積比為10%、解離時間24 h時，得到最佳脫蛋白率為58.17%，多糖保留率為25.29%，多糖的純度同時從6.445%提高到20.3%。

1.3 除色素

除油脂、蛋白質(zhì)外，色素也是植物多糖的雜質(zhì)之一。蛋白去除后，常用活性炭吸附法、雙氧水法、大孔吸附樹脂法、離子交換樹脂法等除去植物多糖中的色素。

1.3.1 活性炭吸附法

活性炭具有多孔結構，其表面含的有氧化物或絡合物可以與被吸附的物質(zhì)發(fā)生結合，而具有較強的吸附力。張麗紅等[17]利用活性炭對紫蘇葉多糖提取液進行脫色。當活性炭用量為0.58%（M/V）、pH 6.0、溫度50 ℃、時間15 min時，脫色率達99.99%，多糖損失率為5.05%。優(yōu)點：操作簡單、成本低、應用廣泛。缺點：活性炭在脫色后難濾除。

1.3.2 雙氧水法

雙氧水法是利用氧化性，使有色物質(zhì)的分子氧化失去原有色素。秦亞東等[18]比較了粉末活性炭、顆?；钚蕴?、過氧化氫、次氯酸鈉對白芍多糖脫色效果。過氧化氫脫色效果最好，多糖保留率和脫色率分別為72.26%、82.55%；其最佳脫色條件為65 ℃，3.5 h，pH 9，過氧化氫體積分數(shù)20%。優(yōu)點：脫色效果較好。缺點：具有強氧化性，破壞多糖結構而損失多糖。

1.3.3 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂具有大孔網(wǎng)狀結構和較大的比表面積，可有選擇地通過物理性質(zhì)吸附物質(zhì)。楊新河等[19]采用D101樹脂對普洱茶多糖同時脫色和除蛋白質(zhì)，當普洱茶多糖溶液體積為50 mL時，在pH 4、50 ℃、料液質(zhì)量濃度3.8 mg/mL、樹脂用量11 mL的條件下，普洱茶多糖的脫色率為82.33%、脫蛋白率為70.89%。Yang R等[20]通過大孔樹脂從南瓜殘渣發(fā)酵液中純化粗多糖。研究了不同極性、直徑和表面積的6種樹脂（AB-8、S-8、HpH480、HPD100、X-5和D101）同時脫色和脫蛋白的效果，結果表明S-8最佳，色素和蛋白質(zhì)的吸附率分別為84.3%和75.9%，多糖的回收率為84.7%；經(jīng)分析，大多數(shù)色素和蛋白質(zhì)被S-8樹脂吸收，也沒有降解多糖。特點：與化學脫色方法相比容易再生，可同時脫色、脫蛋白，且?guī)缀醪话l(fā)生多糖降解。

1.3.4 離子交換樹脂法

離子交換劑對不同離子有不同的吸附能力和置換能力，可選擇性地發(fā)揮作用。Jiang H Y等[21]采用A103S陰離子交換樹脂填充的徑向流動色譜法（RFC）純化靈芝多糖，得出樣品濃度10 mg/mL、體積100 mL、流速2 mL/min、洗脫流速40 mL/min為最佳純化條件，脫蛋白率、脫色率和多糖回收率分別為80.35%、88.52%和85.06%。特點：與傳統(tǒng)化學方法和軸向色譜法相比，RFC可在最短的時間內(nèi)獲得粗多糖，快速、有效處理大量的樣品。

1.4 脫鹽

此外，植物多糖還含有無機鹽等小分子雜質(zhì)，經(jīng)過脫鹽工藝可以取得更嚴格的精制多糖。目前常用的脫鹽法主要有超濾法和透析法。

1.4.1 超濾法

超濾膜以膜兩側(cè)的壓力差為動力，使水及比膜孔徑小的小分子通過超濾膜。王貴金等[22]采用超濾法對鹽析后的人參酸性多糖脫鹽，分別選擇截留分子量為1、3、5、10、30 kD的不同超濾膜包進行脫鹽。洗脫劑為超純水，超濾進口壓力2.5 bar、回流口1.8 bar，蠕動泵轉(zhuǎn)速為10 r/min，期間不斷補充洗脫劑。結果顯示1 kD超濾膜效果較好，酸性多糖純度為94.7%，多糖損失率為4.1%。特點：適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1.4.2 透析法

透析法使用的半透膜只允許小分子物質(zhì)通過，可分離小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。陳達妙等[23]以干物質(zhì)灰分為指標，采用透析袋流水透析滸苔多糖中的鹽，發(fā)現(xiàn)透析袋規(guī)格越大、透析時間越長，其脫鹽效果越好，但多糖損失率也越高。其透析脫鹽最佳條件為7000 Da、透析時間8 h、滸苔多糖溶液濃度6%，灰分可脫除76.95%。特點：步驟簡單、成本低廉、處理量較大，但易流失樣品[22]。

2 分離純化

2.1 溶劑法

2.1.1 分級沉淀

乙醇等有機溶劑會破壞多糖水溶液的氫鍵，降低多糖在水中的溶解度而析出沉淀?？刹捎玫挠袡C溶劑有乙醇、甲醇、丙酮。趙書凡等[24]通過熱水浸提和不同濃度乙醇分級沉淀苦丁茶冬青多糖，得到乙醇終濃度為20%、40%、60%和80%的4種均一、純度較高苦丁茶冬青多糖組分。特點：采用不同濃度的有機溶劑會得到不同組分的多糖沉淀。

2.1.2 季銨鹽沉淀

季銨鹽及其氧化物是一類乳化劑，可與酸性多糖形成不溶性沉淀。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。郭國赟等[25]用季銨鹽沉淀滑菇多糖，得到酸性亞組分1.273 g、中性亞組分0.516 g和堿性亞組分0.301 g。特點：不與中性多糖產(chǎn)生沉淀；常用于酸性多糖的分離，但是當溶液的pH值增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉淀[26]。

2.2 柱層析法

2.2.1 凝膠柱層析

凝膠顆粒之間空隙很小，多糖這一類的大分子難以進入其空隙，凝膠柱層析可按分子量大小分離物質(zhì)。高航等[27]選擇DEAE-C陰離子交換樹脂和SepHadex G-25凝膠柱層析，從蓮子紅衣粗多糖中分離純化得到純度分別為91.16%和90.24%的中性多糖和酸性多糖。特點：可根據(jù)多糖結構大小以不同的流速流出層析柱。

2.2.2 纖維素層析

纖維素層析是通過纖維素陰離子交換劑吸附酸性多糖等離子型物質(zhì)。常用的陰離子交換纖維素有DEAE和ECTEOLA。曾婷等[28]取仙茅粗多糖溶于蒸餾水后過DEAE-纖維素柱進一步純化，并依次用蒸餾水、NaCl溶液梯度洗脫，再進一步經(jīng)SepHarose CL-6B凝膠柱色譜純化，獲得不同相對分子質(zhì)量范圍，質(zhì)量分數(shù)為91.8%，不含核酸、蛋白質(zhì)和色素，均一的純化多糖。特點：酸性強弱不同的酸性多糖可被pH相同而離子強度不同的緩沖液洗脫出來[8]。

2.2.3 大孔樹脂柱層析

大孔樹脂層析通過物理吸附可選擇地吸附分離提純有機物質(zhì)。肖代敏等[29]通過對8種樹脂的考察表明，8種不同樹脂中D101大孔樹脂最適合戴氏蟲草多糖的分離純化，戴氏蟲草多糖的吸附率為（71.85±1.12）%，解吸附率為（74.37±2.94）%，脫色率為（64.84±1.89）%。特點：選擇性好、可再生、應用范圍廣。

2.3 膜分離法

膜分離技術是通過半透膜兩側(cè)的推動力（壓力差、化學位差、電位差等），以選擇透過性膜作為分離介質(zhì)，分離不同粒徑的分子。

2.3.1 超濾

超濾膜除了可脫鹽及小分子雜質(zhì)外，還可進一步純化多糖。馮孟鑫等[30]通過超濾優(yōu)化人參果多糖純化工藝，確定最佳超濾工藝條件為超濾時間35 min、超濾壓力0.3 MPa、料液質(zhì)量濃度2 g/L。該工藝實際膜通量值為61.571 L/（m2·h），與預測最高理論值61.523 L/（m2·h）基本相符，得到77.5%多糖，是未經(jīng)超濾純化樣品中多糖含量24.5%的3.2倍。特點：過濾簡單、易控制、應用廣泛。

2.3.2 微濾

微濾孔徑是一種精密過濾，以壓力差為動力，篩選分離出小分子物質(zhì)。歐陽小艷等[31]以運行溫度30～45 ℃，流速60 L/min，進出口壓力分別為0.2 MPa、0.1 MPa為條件，得到微濾膜純化后純度為83.3%的米糠多糖。特點：有效去除比膜孔大的微粒和微生物，且能耗低、無二次污染、分離效率高。

2.4 色譜分離法

2.4.1 離子交換色譜

不同多糖在一定pH條件下所帶電荷不同，可根據(jù)離子交換色譜法的被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差來實現(xiàn)分離。羅秋蓮等[32]采用DEAE-52陰離子交換柱色譜法以及Sephadex G-100凝膠柱色譜法對鐵皮石斛粗多糖進行分離純化，得到4個不同相對分子質(zhì)量純多糖組分，并經(jīng)分析顯示4種鐵皮石斛多糖純度很高且均一性很好。特點：產(chǎn)物純度高、污染小，但洗脫體積大，后處理麻煩。

2.4.2 凝膠色譜

凝膠色譜是根據(jù)凝膠顆粒間隙小的特點，分離大分子物質(zhì)的分離技術，但此法不適宜粘多糖的分離[26]。常用葡聚糖凝膠（SepHadex）和瓊脂糖凝膠（SepHarose）。肖健等[33]利用DEAE瓊脂糖凝膠柱純化龍膽多糖粗品，分別利用蒸餾水和0.5 mol/L NaCl得到F1 14.1%的中性多糖和F2 63.4%的酸性多糖。特點：設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很好的分離效果。

3 展望

我國植物資源豐富，植物多糖類化合物普遍存在，廣泛的藥理活性和較低的毒性使其具有深入研究的價值。但由于多糖結構復雜、種類繁多、分離純化較困難，在除雜質(zhì)的同時易損失，而限制其后續(xù)研究工作。目前大部分植物多糖的除蛋白、色素等雜質(zhì)及分離純化為分步進行，進而增加多糖的損失率；且不同的純化分離條件會分離出不同質(zhì)量不同類型的精制多糖，這對其生物活性、構效關系及藥效研究都會有較大影響。因此，探索出可同時除去雜質(zhì)又可分離純化、高效低損失的方法具有一定的研究意義，可推進植物多糖的進一步開發(fā)利用。

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（收稿日期：2017-05-26）

（修回日期：2017-06-21；編輯：向宇雁）