王志福 楊意州 劉建波1，李長征 龔德貴 俞向梅

摘要：目的 觀察電針對糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）大鼠脊髓脂氧合酶（LOX）的影響，探討其干預(yù)DPN的作用機制。方法 30只實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、電針組、脂氧素組、黃芩素組，每組6只，模型組大鼠采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素造模，尾靜脈采血檢測血糖，篩選DPN動物模型，不干預(yù)。電針組大鼠選取“腎俞”“足三里”電針2周；脂氧素組大鼠脊髓鞘內(nèi)注射脂氧素3次；黃芩素組大鼠脊髓鞘內(nèi)注射黃芩素3次。電子佛萊毛檢測大鼠機械痛行為學(xué)，RT-PCR檢測大鼠LOX基因水平，ELISA檢測大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘堿性蛋白（MBP）表達。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠機械痛閾值及坐骨神經(jīng)MBP含量顯著降低（P<0.01），大鼠脊髓5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，電針組、脂氧素組和黃芩素組大鼠機械痛閾值和坐骨神經(jīng)MBP含量顯著升高，脂氧素組大鼠脊髓5-LOX mRNA表達顯著降低（P<0.01），電針組和黃芩素組大鼠脊髓5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA表達顯著降低（P<0.01）。結(jié)論 電針能減輕DPN大鼠痛敏反應(yīng)，修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷，其機制可能與抑制脊髓LOX活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病周圍神經(jīng)病變；電針；脊髓；脂氧合酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.013

中圖分類號：R245 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0056-05

Effects of Electroacupuncture Therapy on Expression of Spinal Lipoxygenase

in Rats of Diabetic Peripheral Neuropathy

WANG Zhi-fu1， YANG Yi-zhou1， LIU Jian-bo1， LI Chang-zheng1， GONG De-gui2， YU Xiang-mei1

1. Integrative Medicine College， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China；

2. University of Traditional Chinese Medicine Subsidiary Rehabilitation Hospital， Fuzhou 350003， China

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture therapy on the expression of spinal lipoxygenase （LOX） in rats of diabetic peripheral neuropathy （DPN）； To discuss its mechanism in intervening DPN. Methods Thirty experimental rats were randomly divided into five groups： normal， DPN， electroacupuncture， LXA4 and Baicalein， 6 rats in each group. The model group was injected intraperitoneally with streptozotocin （STZ）， and the animal model of DPN was screened by blood sampling of tail vein with blood glucose， without intervention. Electroacupuncture was applied to bilateral “Shenshu” and “Zusanli” acupoints in electroacupuncture group for two weeks. The LXA4 and Baicalein groups were successfully intrathecal injected 3 times with LXA4 and Baicalein in the DPN rats. The paw withdrawal threshold was measured with electronic Frye fibers. The mRNA levels of LOX in the L4～5 spinal cord of DPN rats were detected with real-time PCR analysis. The protein concentration of sciatic nerve MBP was detected with ELISA analysis. Results Compared with the normal group， the mechanical pain threshold and sciatic nerve MBP content in the model group significantly decreased （P<0.01）， and the levels of 5-LOX， 12-LOX and 15-LOX mRNA in the spinal cord of the model group significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， the mechanical pain threshold and MBP content of sciatic nerve in electroacupuncture group， LXA4 group and Baicalein group significantly increased， and the 5-LOX mRNA level in spinal cord of LXA4 group significantly

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81774385、81704149）；福建省自然科學(xué)基金（2016J01391）；福建省教育廳中青年教師科研項目（JA15250）；福建省高校杰出青年科研人才項目（2015年）；福建省衛(wèi)計委青年科研課題項目（2015-1-79）；福建省自然科學(xué)基金青年創(chuàng)新項目（2015J05163）

通訊作者：俞向梅，E-mail：yxmtcm@163.com

decreased （P<0.01）. The expressions of 5-LOX， 12-LOX and 15-LOX mRNA in electroacupuncture group and Baicalein group significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Electroacupuncture therapy may reduce the pain response and restore the impairment of sciatic nerve in DPN rats through inhibiting the gene expression of LOXs in spinal cord.

Keywords： diabetic peripheral neuropathy； electroacupuncture； spinal cord； lipoxygenase； rats

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病常見并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中發(fā)病率約20%。臨床表現(xiàn)為肢體遠端明顯疼痛、麻木，嚴(yán)重者可致殘；DPN實驗大鼠表現(xiàn)為熱痛覺過敏、機械痛覺超敏或者觸覺遲鈍等感覺異常情況。DPN與其他神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病基礎(chǔ)不同，治療棘手，甚至出現(xiàn)對各類西藥的抵抗，長期應(yīng)用西藥治療有一定的不良反應(yīng)。針刺療法基于中醫(yī)辨證論治原則，治療DPN安全有效，臨床研究表明，電針對急慢性痛均有鎮(zhèn)痛、促進周圍神經(jīng)損傷修復(fù)作用[1]。

研究表明，脂氧合酶（LOX）作為脂氧素（LXA4，抗炎介質(zhì)）及白三烯（致炎介質(zhì)）的關(guān)鍵酶，調(diào)控抗炎與致炎平衡，參與DPN過程；抑制LOX活性，可減少炎癥反應(yīng)，改善DPN癥狀[2-6]。臨床研究表明，電針足三里、腎俞可顯著改善DPN周圍神經(jīng)功能[7-8]。本實驗觀察電針對DPN大鼠機械痛敏反應(yīng)及脊髓LOX的影響，探討電針治療DPN的脊髓中樞機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，5～6周齡，體質(zhì)量220～250 g，上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心，分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將大鼠稱重并編號。所有實驗均遵照國際動物保護和使用指南的規(guī)定實施。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司。華佗牌0.28 mm×15 mm一次性針灸針、電針治療儀，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。脂氧素（LXA4，貨號90410），美國Cayman公司。黃芩素（貨號S2268），美國Selleck公司。LOX引物，上海生工生物工程有限公司合成。IQ5多重實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。38450-電子觸覺測量儀（電子Von Frey），意大利Ugo Basile公司。

1.3 分組及造模

實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、電針組、脂氧素組、黃芩素組，每組6只。模型組采用腹腔注射STZ（按60 mg/kg溶于pH 4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液），尾靜脈采血檢測血糖≥16.7 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)，建立DPN動物模型[9]，不干預(yù)；電針組選取“腎俞”“足三里”電針刺激2周；脂氧素組脊髓鞘內(nèi)注射LXA4 3次；黃芩素組脊髓鞘內(nèi)注射黃芩素3次。成模后，第1、14日觀察機械痛行為學(xué)變化。

1.4 干預(yù)

參照大鼠穴位圖譜取穴[10]，取雙側(cè)“腎俞”“足三里”，電針治療（2 Hz/100 Hz交替，強度≤1 mA；時間30 min）。室溫將大鼠軀干固定于木架上，頭部與四肢可自由活動，靜置20 min后，將一次性針灸針刺入大鼠穴位，通過電針治療儀給予疏密波刺激，強度以引起大鼠后肢肌肉輕微抖動而不嘶叫為宜。

1.5 脊髓鞘內(nèi)注射

大鼠取俯臥位，實驗者食指定位于大鼠脊柱L5-6間隙，右手持微量注射器從間隙垂直緩慢進針，以大鼠尾巴出現(xiàn)顫動或突然側(cè)向甩動作為穿刺成功的標(biāo)志，注入相應(yīng)的藥物（LXA4、黃芩素）。成模后第1、7、14日分別注射1次，其中黃芩素每次注射10 μL（濃度為10 μg/μL），LXA4每次注射10 μL（濃度為0.1 μg/μL）。

1.6 機械痛行為測試

測試環(huán)境為10 cm×20 cm×20 cm有機玻璃籠，將大鼠放入籠內(nèi)靜置10 min后，采用電子佛萊毛法進行檢測，即利用不同強度的纖毛刺激大鼠足掌中心部位，引起大鼠縮爪反應(yīng)。能引起縮爪反應(yīng)的最小纖毛壓力即為大鼠的縮爪反應(yīng)閾值（g），以此反映大鼠機械痛敏情況。

1.7 脊髓脂氧合酶、坐骨神經(jīng)髓鞘堿性蛋白檢測

第14日行為測試結(jié)束后，迅速新鮮取材脊髓（L4-5）背角、坐骨神經(jīng)置于液氮中，-80 ℃冰箱保存待測。

ELISA檢測坐骨神經(jīng)MBP表達。①各組坐骨神經(jīng)組織勻漿離心，取上清液；②96孔酶標(biāo)板加樣，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品各100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 40 min；③用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，濾紙印干；④每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白除外），將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃ 20 min；⑤按③步驟再次洗板；⑥每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板置37 ℃ 10 min，再次洗板；⑦每孔加底物工作液100 μL，置于37 ℃暗處反應(yīng)15 min；⑧每孔加入100 μL終止液混勻，30 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm波長處測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值計算相應(yīng)MBP含量。

RT-PCR檢測脊髓LOX基因表達。組織總RNA提取：冰浴取出新鮮脊髓背角組織，每50～100 mg組織加1 mL Trizol試劑，冰浴超聲勻漿15～20 s；每1 mL Trizol試劑加0.2 mL氯仿，快速震蕩15 s，冰浴5 min，4 ℃、12 000×g離心15 min；加入等體積預(yù)冷異丙醇，混勻，冰浴15 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，棄上清液，吸干異丙醇；加入75%乙醇，重懸沉淀，4 ℃、7500×g離心8 min，棄上清液，消毒濾紙上吸干乙醇；重復(fù)以上步驟，傾去乙醇，空氣干燥；干燥后將沉淀溶于DEPC水，置于70 ℃貯存，沉淀加乙醇于20 ℃貯存；取4 μL總RNA溶液稀釋至1 mL，紫外分光光度計檢測OD260和OD280值，測定其濃度和純度。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：PCR管中依次加入Total RNA、Oligo（dT）15 primer、DEPC H2O （RNase-free），70 ℃變性5 min，冰浴5 min；隨后加入5×M-MLV Reaction buffer、10 mmol/L dNTPs、RNase inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase、DEPC H2O，37 ℃ 水浴60 min，95 ℃水浴5 min，冰浴5 min。

PCR擴增：PCR管中依次加入2 μL Taq PCR Master Mix、Sense primer、Antisense primer、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、dd H2O，混勻，瞬時離心。94 ℃ 5 min，94 ℃45 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min；實時熒光定量PCR儀進行樣本分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，符合正態(tài)分布用方差分析，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗中獨立樣本比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 電針對模型大鼠機械痛行為的影響

與正常組比較，模型組大鼠第1、14日機械痛閾值均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，第14日電針組、脂氧素組、黃芩素組鼠機械痛閾值顯著升高（P<0.01）。見圖1。

2.2 電針對模型大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘堿性蛋白含量的影響

成模后第14日，與正常組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)MBP含量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，電針組、脂氧素組、黃芩素組坐骨神經(jīng)MBP含量顯著升高（P<0.01）。見圖2。

2.3 電針對模型大鼠脊髓脂氧合酶mRNA表達的影響

成模后第14日，與正常組比較，模型組大鼠脊髓5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA表達均顯著上調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，電針組和黃芩素組大鼠5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA表達均顯著下調(diào)（P<0.01），脂氧素組大鼠5-LOX mRNA表達顯著降低（P<0.01）。見圖3。

注：N.正常組；M.模型組；EA.電針組；L.脂氧素組；B.黃芩素組

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖1 各組大鼠足底機械痛閾值比較（—x±s）

注：N.正常組；M.模型組；EA.電針組；L.脂氧素組；B.黃芩素組

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)MBP含量比較（—x±s）

注：N.正常組；M.模型組；EA.電針組；B.黃芩素組；L.脂氧素組

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖3 各組大鼠脊髓LOX mRNA表達比較（—x±s）

3 討論

DPN臨床表現(xiàn)為肢體麻木、刺痛等，屬中醫(yī)學(xué)“消渴”“痹證”范疇，其病機為腎臟陰陽兩虛、經(jīng)絡(luò)痹阻。陽明為五臟六腑之海，主潤宗筋，陽明實則筋骨皮脈得養(yǎng)，經(jīng)絡(luò)得通而痛止，故臨床DPN取穴治療常以“補益陽明，強腎通絡(luò)”為主。足三里為陽明經(jīng)之要穴，具有疏經(jīng)益氣、補腎益精作用，電針足三里、腎俞治療DPN臨床療效明確；實驗研究顯示，電針“足三里”“腎俞”可顯著改善DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、增加神經(jīng)營養(yǎng)因子，減輕氧化應(yīng)激和軸突變性、脫髓鞘程度等[11-13]。

MBP是一種位于致密髓鞘與髓核中的多肽，可與髓鞘脂質(zhì)結(jié)合，維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，促進髓鞘的形成。研究表明，DNP大鼠后肢可出現(xiàn)顯著的痛敏反應(yīng)[14]，坐骨神經(jīng)MBP蛋白表達顯著降低[15]；外周血清MBP升高或坐骨神經(jīng)MBP降低常可反映周圍神經(jīng)損害的范圍和嚴(yán)重程度[16-17]。本研究同樣顯示，DPN大鼠足底出現(xiàn)明顯機械痛敏反應(yīng)，坐骨神經(jīng)MBP含量顯著降低，電針“腎俞”“足三里”可顯著抑制痛覺，促進坐骨神經(jīng)髓鞘修復(fù)。 LOXs是一類非血紅素鐵蛋白的多功能酶，廣泛分布于哺乳動物脊髓、周圍神經(jīng)等組織中，主要以花生四烯酸（AA）為作用底物。根據(jù)底物加氧點的位置不同，主要分為5-LOX、12-LOX、15-LOX。LOXs可催化AA生成內(nèi)源性抗炎脂類介質(zhì)脂氧素和致炎脂類介質(zhì)白三烯，其異常表達可打破抗炎和致炎的平衡，導(dǎo)致疾病發(fā)生[18-19]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，LOXs在DPN及抗炎致炎中扮演著重要角色，抑制12/15-LOX可通過降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)減輕DPN發(fā)生發(fā)展[2-5]。此外，STZ誘導(dǎo)糖尿病發(fā)生過程中，外周血液中5-LOX及5-LOX激活蛋白表達上調(diào)[20]；轉(zhuǎn)基因小鼠FLAP過表達可促進脂肪組織LXA4生成，減輕胰島素抵抗，進一步明確LXA4在糖尿病中的抗炎保護作用[21]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針治療神經(jīng)痛及慢性炎性痛，LXA4參與電針的抗炎鎮(zhèn)痛過程，電針及黃芩素顯著改變神經(jīng)痛大鼠脊髓LOX含量而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[22-23]。本實驗結(jié)果同樣顯示，電針及12/15-LOX抑制劑（黃芩素）、LOX抗炎產(chǎn)物L(fēng)XA4，可顯著抑制脊髓5-LOX、12-LOX、15-LOX，促進坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)，從而減輕機械痛敏反應(yīng)。然而脊髓鞘內(nèi)注射LXA4僅抑制5-LOX活性，以發(fā)揮鎮(zhèn)痛和周圍神經(jīng)修復(fù)作用，并未影響12-LOX、15-LOX活性，其機制有待今后進一步深入研究。

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（收稿日期：2017-10-30）

（修回日期：2017-11-04；編輯：華強）