沈昕 呂娟 李曉保 朱有家*

自體骨是硬組織缺損重建的理想材料，被廣大學(xué)者視作骨移植的金標(biāo)準(zhǔn)。牙齒和下頜骨均由外胚間葉的神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，且具有相似的化學(xué)組成[1,2]，有學(xué)者提出，自體牙齒可替代自體骨用于骨移植，以避免自體骨移植造成的供骨區(qū)并發(fā)癥等問(wèn)題。早在上個(gè)世紀(jì)就有研究發(fā)現(xiàn)，從牙齒中能夠提取出具誘導(dǎo)成骨性能的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein,BMP）[3]，這為自體牙作為骨移植材料提供了理論依據(jù)。本研究利用經(jīng)不同脫礦時(shí)間處理的梯度脫礦自體牙作為牙槽骨增量材料，觀察不同脫礦時(shí)間對(duì)成骨效果的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

MAO2-1.5*7鈦合金螺釘（慈北醫(yī)療器械有限公司，寧波）； 顱頜面外科手術(shù)工具（慈北醫(yī)療器械有限公司，寧波）；戊巴比妥鈉（天盛興生物科技有限公司，武漢）；硫酸慶大霉素注射液（華中藥業(yè)股份有限公司，襄陽(yáng)），光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLYMPUS，日本）；RAY系列牙科X射線機(jī)（藍(lán)野醫(yī)療，寧波）；掃描電子顯微鏡（日立S-570，日本）；口腔種植無(wú)菌手術(shù)包（武漢大學(xué)中南醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，武漢）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)新西蘭兔16只，雌雄不限，3～6月齡，體重2.5 kg～3.0 kg，購(gòu)于武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司（許可證號(hào)：SYXK（鄂）2009-0025），常規(guī)條件下，分籠飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本實(shí)驗(yàn)獲武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 確定骨移植手術(shù)部位

參考鄂玲玲等提出的新型兔牙槽骨缺損模型解剖兔下頜骨[4]，見(jiàn)下頜切牙遠(yuǎn)中有一無(wú)牙區(qū)域（見(jiàn)圖1黑色方塊區(qū)域），骨壁較厚，制備骨缺損時(shí)不會(huì)傷及下頜切牙牙根。

圖1，體外確定建模位置（黑色方塊區(qū)域?yàn)榻^(qū)，箭頭指示為頦孔）。

1.4 骨增量材料制備及結(jié)構(gòu)觀察

本實(shí)驗(yàn)是為了推斷合理的脫礦時(shí)間范圍，因此根據(jù)課題組前期所獲專利及相關(guān)體外預(yù)試驗(yàn)所得到的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)[5]，脫礦后的牙齒需要具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，通常以脫礦后針能輕輕刺入而無(wú)法刺穿為標(biāo)準(zhǔn)，選擇10%、5%兩種濃度的鹽酸進(jìn)行不同時(shí)間的二次法對(duì)收集的離體兔牙進(jìn)行梯度脫礦，排除使用脫礦后牙齒可被輕易穿透的時(shí)間組，最終決定10%鹽酸脫礦30 min，而后續(xù)5%鹽酸若脫礦時(shí)間長(zhǎng)于40 min易致使牙齒喪失強(qiáng)度，隨將實(shí)驗(yàn)對(duì)象的16只新西蘭兔隨機(jī)分為 A-D 4組，對(duì)各組自體牙脫礦條件（見(jiàn)表1）。脫礦完成后每組取一個(gè)樣本經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定后用掃描電鏡觀察表面結(jié)構(gòu)特征。

表1，各組家兔自體牙脫礦條件

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重后1%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉（3 mL/kg），仰臥位固定，上頜切牙區(qū)域消毒，分離牙齦，拔除切牙，去除牙根，磨除表層釉質(zhì)，將牙齒制備為10 mm×4 mm×3 mm大小的牙片，在其中心部位用金剛砂車針制備一個(gè)直徑1.5 mm長(zhǎng)的圓。按表1所示進(jìn)行脫礦處理，經(jīng)鹽酸處理的自體牙片每次從鹽酸中取出后需用生理鹽水反復(fù)沖洗，避免殘留；D組始終浸泡于生理鹽水中。制備好的材料按相應(yīng)編號(hào)浸泡于生理鹽水中待用。

1.5 骨增量材料移植

右側(cè)下頜區(qū)備皮、消毒、鋪巾。在距兔口角約10 mm處緊貼下頜骨上緣作一長(zhǎng)約15 mm的切口，鈍性分離至骨膜，切開(kāi)骨膜，暴露下頜切牙遠(yuǎn)中無(wú)牙區(qū)，磨除表面骨皮質(zhì)，250 mL生理鹽水中加入8萬(wàn)單位慶大霉素配置成沖洗液，術(shù)中不間斷沖洗術(shù)區(qū)。將制備好的自體增量材料用鈦釘（1.5 mm×7.0 mm）固定于術(shù)區(qū)，分層縫合骨膜、肌肉及皮膚，術(shù)后飼喂青霉素粉末7天。

1.6 X線檢查

術(shù)后即刻各組分別處死1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取材后行 X線觀察。術(shù)后3個(gè)月，處死全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后取出含移植材料的骨塊行X線觀察。

1.7 HE染色

常溫下4%多聚甲醛固定1周，8%硝酸溶液快速脫鈣處理，流水沖洗24 h，常規(guī)脫水包埋，在靠近鈦釘處沿鈦釘長(zhǎng)軸方向做連續(xù)切片，每組各制作3張切片，HE染色。

1.8 定量分析

術(shù)后3個(gè)月，測(cè)量各樣本鈦釘與移植區(qū)表面垂直距離，每個(gè)樣本選取4個(gè)位點(diǎn)，記錄數(shù)值。OLYMPUS顯微鏡下觀察并采集圖像，每張切片隨機(jī)取4個(gè)視野拍照，用Image J圖像分析軟件選取未降解移植物，測(cè)量其相對(duì)面積（a），再選取視野下全部組織并測(cè)量出其相對(duì)面積（b），最后計(jì)算出移植材料相對(duì)留存率（a/b）的值，取平均數(shù)。采用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，Dunnett-t檢驗(yàn)分析比較各處理組移植材料相對(duì)留存率，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組移植材料掃描電鏡觀察結(jié)果

圖 2，不同條件處理后的自體牙移植材料表面結(jié)構(gòu)特征（6000×，SEM）。

掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，自體牙片在不同時(shí)間脫礦處理的作用下，表面結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。D組（見(jiàn)圖2D）表面結(jié)構(gòu)較為致密，牙本質(zhì)小管排列緊密；而隨著脫礦時(shí)間的增加，由C組（見(jiàn)圖2C）到A組（見(jiàn)圖2A），牙片表面結(jié)構(gòu)逐漸變得疏松，膠原纖維束暴露，而在 A組中，膠原纖維束喪失原本有序的結(jié)構(gòu)，排列凌亂。

2.2 骨增高術(shù)后觀察

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后1天均恢復(fù)自主進(jìn)食。術(shù)后3個(gè)月，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下頜骨移植區(qū)傷口均愈合良好，未見(jiàn)感染跡象。

2.3 大體觀察

術(shù)后3個(gè)月肉眼觀察，A組鈦釘頂部與骨面之間有一間隙，未見(jiàn)移植物存在；B組、C組鈦釘頂端與移植區(qū)表面結(jié)合緊密，鈦釘頂部可見(jiàn)新骨爬行覆蓋，仍可辨認(rèn)部分移植物存在；D組鈦釘頂部未見(jiàn)新骨覆蓋，移植物形態(tài)清楚，與周圍骨組織界限清晰。

2.4 X線觀察

圖3，骨增量術(shù)后即刻與3個(gè)月X線影像（白色箭頭所示為骨增量區(qū)域）。

術(shù)后即刻X線觀察結(jié)果顯示，隨著脫礦時(shí)間的增加，移植物密度降低（見(jiàn)圖3A-D）。術(shù)后3個(gè)月X線觀察結(jié)果顯示，鈦釘與下頜骨發(fā)生穩(wěn)定結(jié)合，未見(jiàn)明顯暗影，與術(shù)后即刻影像相比發(fā)生較為明顯的改變；A組（見(jiàn)圖3E）鈦釘頂端與周圍組織未接觸，周圍低密度影；B組（見(jiàn)圖3F）和C組（見(jiàn)圖3G）可見(jiàn)部分移植物影像，鈦釘與移植區(qū)表面接觸較為緊密，C組移植區(qū)影像密度高于B組，移植物與下頜骨之間界限不清，二組移植區(qū)密度均高于術(shù)后即刻影像；D組（見(jiàn)圖3H）骨增量區(qū)見(jiàn)清晰的牙齒形態(tài)，與下頜骨分界明顯。

2.5 HE染色

圖4，骨增量術(shù)后3個(gè)月HE染色（Tooth：移植牙齒；黑色箭頭：骨改建區(qū)，彩圖見(jiàn)插頁(yè)）。

術(shù)后3個(gè)月，A組（圖4A）未見(jiàn)明顯骨改建，未見(jiàn)牙樣結(jié)構(gòu)存在；B組（圖4B）見(jiàn)骨改建區(qū)，毛細(xì)血管及成骨細(xì)胞出現(xiàn)，有較均勻的新骨形成，未見(jiàn)明顯牙樣結(jié)構(gòu)；C組（圖 4C）可見(jiàn)有大面積骨改建區(qū)，骨祖細(xì)胞、破骨細(xì)胞出現(xiàn)，新骨取代原有移植物，骨改建區(qū)內(nèi)見(jiàn)少量牙樣結(jié)構(gòu)；D組（圖4D）見(jiàn)大面積牙樣結(jié)構(gòu)，邊緣呈蠶食狀，分界明顯，骨改建區(qū)邊緣有骨母細(xì)胞出現(xiàn)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在術(shù)后3個(gè)月，B組、C組、D組骨增量能力無(wú)顯著差異性（＞0.05）；A組骨增量能力弱于D組（＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。

表2，各組鈦釘與移植區(qū)表面垂直距離比較（±s,mm）

表2，各組鈦釘與移植區(qū)表面垂直距離比較（±s,mm）

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術(shù)后3個(gè)月，各組移植材料相對(duì)留存率具有顯著性差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）（見(jiàn)表3），隨著脫礦時(shí)間的增加，移植材料降解的速度增加。

表3，各組移植材料相對(duì)留存率比較（±s,%）

表3，各組移植材料相對(duì)留存率比較（±s,%）

組別 移植材料相對(duì)留存率A B C D 1.02±0.59 8.58±0.64 32.23±3.72 55.46±2.85

3 討論

理想的骨移植材料應(yīng)具備以下條件：表面結(jié)構(gòu)類似于天然骨，生物相容性優(yōu)越；生物降解速率與新骨形成速率相匹配；具有一定的機(jī)械強(qiáng)度及硬度，能夠維持空間形態(tài)；可提供促進(jìn)新骨形成的相關(guān)生長(zhǎng)因子[6]。牙齒具有與皮質(zhì)骨相似的表面結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成[7]。臨床上觀察發(fā)現(xiàn)，外傷牙牙根的牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)可與牙槽骨發(fā)生置換性吸收，產(chǎn)生骨性粘連[8]，提示牙齒可與骨整合。牙齒作為一種自體材料，不存在傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)與發(fā)生免疫排異反應(yīng)的可能，且來(lái)源豐富，因牙周病或無(wú)功能第三磨牙拔除所獲得的牙齒形態(tài)完整，無(wú)需對(duì)患者進(jìn)行二次手術(shù)，制成塊狀牙片后具有一定的硬度和強(qiáng)度，是一種可期的骨替代材料。本實(shí)驗(yàn)中采用不同脫礦時(shí)間處理的二次脫礦自體牙片進(jìn)行移植手術(shù)，顯示隨著脫礦時(shí)間增加，牙片的吸收速度增加，在一定脫礦時(shí)間范圍內(nèi)，經(jīng)處理的自體牙片能與骨發(fā)生漸進(jìn)性整合，實(shí)現(xiàn)骨增量效果。

組織學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月時(shí)，未脫礦自體牙片（D組）尚未與骨組織發(fā)生牢固結(jié)合，移植物邊緣可見(jiàn)破骨細(xì)胞吸收原移植物，有骨改建區(qū)出現(xiàn)；過(guò)度脫礦的自體牙片（A組）早期被破骨細(xì)胞吸收，成骨細(xì)胞不能沿牙片支架爬行，無(wú)法達(dá)到骨增量的目的；恰當(dāng)脫礦時(shí)間處理的自體牙片（B組、C組）則與骨發(fā)生置換性吸收，新骨沿牙片支架爬行并逐漸取代原移植物，形成了骨整合，且隨著脫礦時(shí)間增加，牙片被新骨吸收取代的速率增加。

牙齒植入機(jī)體后誘發(fā)改建，與其中含有的有機(jī)成分有關(guān)，BMP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞生成，Ⅰ型膠原和其他非膠原蛋白（如骨鈣蛋白等）參與軟骨和骨的鈣化過(guò)程，BMP單獨(dú)植入機(jī)體中會(huì)快速降解而無(wú)法發(fā)揮成骨效果，必須與Ⅰ型膠原或羥基磷灰石聯(lián)合應(yīng)用[8]。未脫礦的牙齒中含有大量羥基磷灰石，阻礙BMP的釋放[10]，新骨形成速度較慢，而經(jīng)過(guò)適度脫礦后，牙中的有機(jī)成分仍存在活性，牙本質(zhì)小管周圍有機(jī)基質(zhì)暴露，膠原纖維束松弛，為BMP等生長(zhǎng)因子的釋放提供通道[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，自體牙經(jīng)過(guò)不同條件處理后置于6000倍掃描電子顯微鏡下觀察表面結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隨著脫礦時(shí)間的增加，膠原纖維束的松弛度逐漸增加，直至完全喪失原有的結(jié)構(gòu)與排列。脫礦時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致過(guò)度脫礦，如本實(shí)驗(yàn)中的 A組，膠原纖維及羥基磷灰石結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，原支架材料被迅速吸收，BMP直接進(jìn)入機(jī)體中，發(fā)生快速降解，難以發(fā)揮誘導(dǎo)成骨的作用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)骨增量效果，這亦與觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。

自體牙取材方便，無(wú)需二次手術(shù)，降低了經(jīng)濟(jì)成本與時(shí)間成本，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理即可使用，易于被患者接受，近十年來(lái)在亞洲廣泛應(yīng)用[9,11,12]，多數(shù)學(xué)者將自體牙制備成為粉末狀或片屑狀材料，存在不易塑形及難以維持局部空間結(jié)構(gòu)的問(wèn)題；傳統(tǒng)未脫礦自體牙降解速率低，修復(fù)周期長(zhǎng)，需要考慮結(jié)合其他生長(zhǎng)因子使用[13]。

本課題組早期針對(duì)單一濃度脫礦人牙本質(zhì)中的無(wú)機(jī)物及有機(jī)物含量進(jìn)行過(guò)相應(yīng)研究，原位衰減全反射紅外光譜圖（ART）與X射線能譜儀的結(jié)果都顯示，在合適的脫礦濃度下，脫礦時(shí)間的增加對(duì)無(wú)機(jī)物的含量有明顯的影響，但對(duì)于有機(jī)物幾乎沒(méi)有影響[14]，而且，在牙齒材料中出現(xiàn)一個(gè)明顯分界區(qū)域，將材料分為外部的脫礦區(qū)和內(nèi)部完全未脫礦區(qū)，該區(qū)無(wú)機(jī)物相對(duì)含量不隨脫礦時(shí)間的變化而發(fā)生改變，之前有學(xué)者進(jìn)行的牙本質(zhì)酸液脫礦后的分層結(jié)構(gòu)分析也顯示相同的現(xiàn)象[15]，在單一濃度脫礦的牙齒中不會(huì)出現(xiàn)礦物質(zhì)濃度呈階梯性的變化，深層生長(zhǎng)因子無(wú)法充分釋放。后期，本實(shí)驗(yàn)組針對(duì)人牙進(jìn)行了梯度脫礦處理后的體外檢測(cè)[5]，ART光譜顯示，代表有機(jī)物的酰胺基團(tuán)的吸收波譜范圍在1650cm-1，而代表無(wú)機(jī)物的磷酸基團(tuán)的吸收波譜在1050cm-1，從表面到中心，形成了孔隙率不同的多孔結(jié)構(gòu)，無(wú)機(jī)物與有機(jī)物的相對(duì)含量從表面向中心呈現(xiàn)梯度性的變化，并且具有一定的硬度和彈性，能夠維持空間結(jié)構(gòu)并避免對(duì)下頜骨產(chǎn)生壓迫導(dǎo)致骨吸收[5]，在早期就能形成良好的結(jié)合，說(shuō)明牙齒是牙槽骨增量手術(shù)比較理想的植入材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了梯度脫礦自體牙作為骨增高材料的可行性。

應(yīng)當(dāng)指出的是，梯度脫礦的時(shí)間是該方法成功與否的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)就兔牙的脫礦時(shí)間提出了大致的推斷范圍，初步圈定了時(shí)間范圍，但由于人牙與兔牙的尺寸不同，所含化學(xué)成分的量可能亦略有差異，需要后期繼續(xù)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的材料性能檢測(cè)以加強(qiáng)說(shuō)服力，并且在后期進(jìn)一步細(xì)化，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定最優(yōu)的脫礦時(shí)間范圍。

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