□ 鮑宗源 布振錢(qián) 郝曉妤 呂曉萌 孫靖瑩 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院

由于能夠特異性結(jié)合單糖、多糖和糖蛋白，植物凝集素在醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)和農(nóng)學(xué)方面發(fā)揮了巨大的作用和價(jià)值[1]。紫花油豆（菜豆）是我國(guó)東北地區(qū)分布的一種地方性物種。其中蛋白質(zhì)含量達(dá)20%以上。這些蛋白質(zhì)其合理的氨基酸組成和較高的凝集素含量，使其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物學(xué)價(jià)值。

作為傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離方法，硫酸銨沉淀法也用于提取凝集素。此方法的缺點(diǎn)是它耗時(shí)長(zhǎng)且產(chǎn)量低[2]。親和層析法大大提高了凝集素的產(chǎn)量，但其工業(yè)化成本高且難以擴(kuò)大生產(chǎn)[3]。因此，建立一種快速、經(jīng)濟(jì)高效的凝集素提取方法，以提高選擇性和產(chǎn)量，降低成本尤為重要。

目前，雙水相提取技術(shù)也被嘗試用于分離純化凝集素。2010年，Nascimento[4]研究了Canavaliabrasiliensis凝集素（ConBr ）在PEG600/磷酸鹽體系以及PEG600/檸檬酸鈉體系中的分配。Soares[5]研 究 了 在 PEG8000/檸檬酸鹽體系中，從Canavaliaensiformis種子的粗提取物中提取和純化ConcanavalinA(ConA)。Nascimento[6]采用PEG8000/檸檬酸鈉體系從Cratyliamollis種子中提取凝集素。結(jié)果表明，PEG/鹽雙水相體系在提取凝集素方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。

本項(xiàng)研究，以PEG600/(NH4)2SO4雙水相體系作為提取工具，以紫花油豆為原料，建立一種直接從豆類(lèi)粗提液中提取凝集素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

紫花油豆種子，哈爾濱香坊區(qū)貢賓種子公司；聚乙二醇600（PEG600），天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，天津市耀華化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨（分析純），上海成捷化學(xué)有限公司；福林酚試劑（分析純）、牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)：T6新世紀(jì)）/北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電泳試劑盒/北京索萊寶科技有限公司；Mini-PROTEAN電泳儀/Bio-RAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 凝集素的粗提取

挑選籽粒飽滿(mǎn)的紫花油豆種子，用粉碎機(jī)粉碎，將充分粉碎后的紫花油豆種子過(guò)50目篩，得到的粉狀物用1∶6（w/v）石油醚脫脂處理，重復(fù)3次后在4℃下使用0.02mol/L磷酸鹽溶液浸提12 h，浸提液離心，10 000 rpm離心35min，得到的上清液作為雙水相提取的原料，4℃儲(chǔ)存。

1.3.2 雙水相萃取

將 90%（w/w）PEG600溶 液、25%（w/w）(NH4)2SO4溶 液、1mL粗提液依次加入10mL帶有刻度的玻璃離心管中，使體系總體積為5mL，再加入NaCl固體，置于渦流混勻器上混勻后，使用NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，在2000g離心10min后完成相分離。測(cè)量相體積后，收集上相以測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和進(jìn)行電泳分析。

1.3.3 Folin's酚法測(cè)定凝集素的含量

使用BSA（牛血清白蛋白）作為標(biāo)準(zhǔn)，在650nm讀取樣品的吸光度。

1.3.4 測(cè)定血凝活性

在微量滴定板中進(jìn)行凝血活性（HA）的測(cè)定。將凝集素（50μL）用中風(fēng)生理鹽水溶液進(jìn)行2倍系列稀釋?zhuān)砑?0μL的2%兔紅細(xì)胞懸浮液。當(dāng)陰性對(duì)照完全沉積時(shí)，在室溫下45 min后讀取結(jié)果。

1.3.5 凝集素特異性活力計(jì)算

式中：H代表特異性活力，Ct代表粗蛋白溶液中蛋白質(zhì)的濃度。

1.3.6 雙水相體系參數(shù)的定義

式中：Ks代表上相蛋白得率，Cs代表上相蛋白濃度，Vs代表上相蛋白體積，mt代表粗蛋白質(zhì)量，Hs代表上相蛋白特異性活力，Ht代表粗蛋白特異性活力，Gs代表上相蛋白純化倍數(shù)。

2 雙水相單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

不同濃度(NH4)2SO4上相純化倍數(shù)和得率，如圖1所示。

由圖1可知，上相蛋白得率與純化倍數(shù)隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)(NH4)2SO4達(dá)到25%時(shí)純化倍數(shù)與蛋白得率達(dá)到最大值，隨著(NH4)2SO4繼續(xù)增加，上相蛋白得率與純化倍數(shù)呈下降趨勢(shì)。分析其原因?yàn)椋寒?dāng)(NH4)2SO4為15%時(shí)，由于體系中離子強(qiáng)度較低兩相之間的疏水作用力差異性較小，此時(shí)蛋白大部分分配到鹽相；隨著(NH4)2SO4的增加，體系中離子強(qiáng)度增加，疏水作用力增強(qiáng)，蛋白在鹽相中的溶解性降低，迫使蛋白由下相向上相移動(dòng)，所以上相蛋白得率和純化倍數(shù)都逐漸增加，當(dāng)(NH4)2SO4為25%時(shí)二者達(dá)到最大值。當(dāng)(NH4)2SO4大于25%時(shí)，高濃度的鹽溶液會(huì)破壞蛋白表面水化膜，蛋白溶解度降低，使部分凝集素蛋白沉淀出來(lái)，所以上相蛋白得率與純化倍數(shù)降低。

2.2 PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

不同濃度PEG600上相純化倍數(shù)與得率，如圖2所示。

由圖2可知，上相蛋白得率與純化倍數(shù)隨PEG600增加而增加，當(dāng)PEG600為90%時(shí)二者達(dá)到最大值，之后隨著PEG600的繼續(xù)增加，上相蛋白得率與純化倍數(shù)呈下降趨勢(shì)。當(dāng)PEG600為50%時(shí)，不能夠形成雙水相體系；當(dāng)PEG600為60%時(shí)，兩相之間疏水作用力差異性較小，PEG600相剝奪水分子能力弱，下相中鹽離子濃度較小，下相中鹽析作用較小，不能推動(dòng)蛋白由一相向另一相移動(dòng)；隨著PEG600的增加，PEG600相剝奪水分子能力增強(qiáng)，上相體積增大，下相體積減小，兩相之間疏水作用力增大，促使凝集素蛋白由下相向上相移動(dòng)，使上相蛋白得率與純化倍數(shù)隨之增加；當(dāng)PEG600為100%時(shí)，上相中的空間斥力作用加強(qiáng)，體系的黏度增加，下相中的凝集素蛋白分子停留在兩相界面處，在兩相之間形成一層乳化層，從而阻礙了凝集素蛋白分子在相間的傳遞和擴(kuò)散，降低了上相蛋白得率與純化倍數(shù)。

2.3 pH值對(duì)提取效果的影響

不同pH值上相純化倍數(shù)與得率，如圖3所示。

由圖3可知，上相蛋白得率與純化倍數(shù)隨pH值增加而上升，在pH為7.5時(shí)上線蛋白得率與純化倍數(shù)達(dá)到最大，之后隨著pH值增大，上線蛋白得率與純化倍數(shù)同時(shí)下降。pH值的變化一方面影響鹽離子的種類(lèi)，另一當(dāng)面改變蛋白質(zhì)所帶電荷的狀態(tài)，當(dāng)pH值較低時(shí)，體系pH值處在凝集素蛋白的等電點(diǎn)附近，凝集素蛋白聚集在一起，形成沉淀，同時(shí)兩相之間不能形成跨越界面的電位差，不能促使凝集素蛋白從一相向另一相移動(dòng)；隨著pH值的增加，體系pH值遠(yuǎn)離蛋白的等電點(diǎn)，兩相之間蛋白分配越不均勻越有利于蛋白從一相向另一相移動(dòng)，當(dāng)pH值達(dá)到7.5時(shí)兩者達(dá)到最大值；隨著pH值的繼續(xù)增大，堿性條件下銨根離子與氫氧根離子結(jié)合，釋放出氨氣，溶液中離子濃度降低，推動(dòng)蛋白移動(dòng)的作用力減小，使得上線蛋白得率與純化倍數(shù)下降。

圖1 不同濃度(NH4)2SO4上相純化倍數(shù)和得率

圖2 不同濃度PEG600上相純化倍數(shù)與得率

圖3 不同pH值上相純化倍數(shù)與得率

3 結(jié)論

研究得到PEG600/(NH4)2SO4雙水相萃取紫花油豆中凝集素的最優(yōu)條 件 為（ 體 系 共5mL）：3mL的25%(NH4)2SO4溶 液（w/w），1mL的90%PEG600溶液（w/w），粗提液體積1mL，體系pH值為7.5，此時(shí)上相蛋白得率為42.32%，純化倍數(shù)為3.08。

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