□ 胡路平 季 昱 杭州市富陽區(qū)食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心

金黃色葡萄球菌是食品中的重要微生物檢測(cè)指標(biāo)，是造成食品污染、細(xì)菌性食物中毒等的主要食源性致病菌之一。在冷凍食品、動(dòng)物性食品和蔬菜制品、糧食制品等食品中常有檢出[1]。在我國乃至全球，因金黃色葡萄球菌造成的食物中毒事件屢見不鮮。本研究采用檢測(cè)試紙法[2]、Baird-Parker平板（以下簡稱BP平板）國家標(biāo)準(zhǔn)法[3]和常規(guī)PCR法三種方法，對(duì)10-1CFu/ml至103CFu/ml系列濃度梯度的金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌液分別進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)和試驗(yàn)，通過對(duì)不同檢驗(yàn)方法的比較和研究，分析各自的優(yōu)缺點(diǎn)，具有一定的研究價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923，購買自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心。BP平板、凍干兔血漿等其它試劑材料，購買自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。金黃色葡萄球菌PetrifilmTM檢測(cè)試紙，由美國3M公司生產(chǎn)。全自動(dòng)微生物鑒定分析儀VITEK 2 Compact及配套GP檢測(cè)卡、試劑，由法國生物梅里埃制造和生產(chǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因擴(kuò)增儀7500型及配套試劑盒，由美國ABI制造和生產(chǎn)。

1.2 方法

將購得的金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923復(fù)活、傳代至2代，轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂小斜面，將純菌苔接種于試管中，36 ℃培養(yǎng)18 h制得試驗(yàn)菌液，菌液濃度約為2.0×105CFU/mL。用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋獲得相應(yīng)稀釋度菌液。

1.2.1 檢測(cè)試紙法

方法詳見SN/T 1895-2007《食品中金黃色葡萄球菌的快速計(jì)數(shù)法PetrifilmTM測(cè)試片法》。具體檢測(cè)步驟和判斷依據(jù)參照檢測(cè)試紙說明書。

1.2.2 BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法

根據(jù)GB4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第一法定性檢驗(yàn)和第二法平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。其中定性檢驗(yàn)的主要步驟有檢樣處理、增菌、分離、鏡檢、腸毒素檢驗(yàn)等，定量實(shí)驗(yàn)主要步驟有：檢樣處理、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和確認(rèn)試驗(yàn)等。

1.2.3 常規(guī)PCR法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)）

常規(guī)PCR方法能夠?qū)χ虏【焖俣ㄐ?，但是如果想要進(jìn)行金黃色葡萄球菌定量分析，則需要在常規(guī)PCR 方法的基礎(chǔ)上通過加入熒光染料等手段才能實(shí)現(xiàn)[4]。本次研究并未對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行PCR定量試驗(yàn)。本次定性試驗(yàn)，主要是將一系列稀釋度菌液中的金黃色葡萄球菌DNA提取，經(jīng)過處理與對(duì)照一起加入配套試劑上機(jī)擴(kuò)增，最后得出定性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性檢測(cè)結(jié)果比較

由實(shí)驗(yàn)可知，三種金黃色葡萄球菌定性檢測(cè)方法在本次研究所選取的103CFu/ml至10-1CFu/ml 5個(gè)菌液稀釋度中，檢測(cè)靈敏度隨著菌液稀釋度降低均呈下降趨勢(shì)，檢測(cè)靈敏度排序?yàn)椋築P平板國標(biāo)法＜檢測(cè)試紙法＜常規(guī)PCR法。在低濃度情況下，BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法（100CFu/ml及更低稀釋度）和檢測(cè)試紙法（10-1CFu/ml及更低稀釋度）基本無檢出，PCR法在10-1CFu/ml菌液稀釋度下仍具有檢出率，具體見表1。

2.2 定量檢測(cè)結(jié)果比較

在定量檢測(cè)中，菌液濃度越高，BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法和檢測(cè)試紙法因?yàn)榫渎雍途涿懿?，按照國家?biāo)準(zhǔn)和試紙操作說明均無法計(jì)數(shù)（具體見表2），檢測(cè)不具有意義。102CFU/mL菌液稀釋度下，BP平板國標(biāo)法具有檢測(cè)意義，而檢測(cè)試紙法仍然無法計(jì)數(shù)。在低菌液稀釋度（10-1CFU/mL）下，BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法靈敏度低、無檢出，而檢測(cè)試紙法有檢出，相比而言具有更高的靈敏度。在101CFU/mL至100CFU/mL菌液稀釋度，BP平板國標(biāo)法和檢測(cè)試紙法均有檢出，且計(jì)數(shù)結(jié)果無顯著差異。

2.3 其他方面的比較

BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法檢驗(yàn)程序相比較而言檢驗(yàn)程序較復(fù)雜，耗時(shí)最長，一般需要2～4 d，當(dāng)需要快速檢測(cè)出結(jié)果時(shí)就較難滿足要求。BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法中對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾因素較多，如實(shí)驗(yàn)材料（培養(yǎng)基、腸毒素分型試劑盒等）質(zhì)量、微生物生長環(huán)境（溫度、濕度、pH等）、雜菌干擾等。同時(shí)，會(huì)出現(xiàn)受到過熱傷害的目的菌在培養(yǎng)基上未生長從而造成的假陰性的情況。但是，BP平板國標(biāo)法相較而言具有更低的經(jīng)濟(jì)成本優(yōu)勢(shì)，在不追求檢測(cè)速度時(shí)被廣泛地應(yīng)用。

表1 金黃色葡萄球菌各檢測(cè)方法的定性結(jié)果

表2 金黃色葡萄球菌各檢測(cè)方法的定量結(jié)果

檢測(cè)試紙法發(fā)展至今技術(shù)也已較為成熟，獲得了很多權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證，一般需要1～2 d，具有操作簡易、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，不需要配合其他生化鑒定試驗(yàn)、在較低菌液稀釋度仍能檢出的高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)試紙法成本較高，容易受雜菌干擾，當(dāng)菌含量較多時(shí)不易計(jì)數(shù)。檢測(cè)試紙法也會(huì)出現(xiàn)因目的菌受到過熱傷害而造成的假陰性現(xiàn)象。

常規(guī)PCR法一天之內(nèi)就可出檢驗(yàn)結(jié)果，甚至幾個(gè)小時(shí)就可完成，具有最高的檢出靈敏度和實(shí)際檢出率，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員實(shí)驗(yàn)素質(zhì)和實(shí)驗(yàn)硬件要求很高，實(shí)驗(yàn)成本也較高。它的快捷性、特異性和準(zhǔn)確性，使它具有非常好的發(fā)展前景和重要的現(xiàn)實(shí)意義。它不涉及冗長的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)、菌落特征、細(xì)胞特征和相應(yīng)的生化試驗(yàn)，經(jīng)過改進(jìn)和設(shè)計(jì)，也可以進(jìn)行金黃色葡萄球菌的快速的定量檢測(cè)（本次研究未涉及）。常規(guī)PCR法在實(shí)驗(yàn)中也會(huì)出現(xiàn)出現(xiàn)假陽性、假陰性的情況。常規(guī)PCR法可以避免BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法和檢測(cè)試紙法由于目的菌受熱處理傷害而造成的假陰性現(xiàn)象，更加真實(shí)可靠地反映食品受金黃色葡萄球菌污染的程度。

3 結(jié)論

本研究通過金黃色葡萄球菌的定性實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面，簡要對(duì)比了檢測(cè)試紙法、BP平板國家標(biāo)準(zhǔn)法和PCR法三種方法的差異，在實(shí)驗(yàn)精度、實(shí)驗(yàn)周期、實(shí)驗(yàn)成本等方面，三種方法各具優(yōu)缺點(diǎn)。

隨著食品檢測(cè)技術(shù)的朝著高準(zhǔn)確性、高精度、高靈敏度的方向日益發(fā)展，對(duì)微生物檢測(cè)工作者的要求也越來越高。只有通過研究、摸索和實(shí)踐，將金黃色葡萄球菌等致病菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和先進(jìn)科技結(jié)合起來，才能更好地提高檢測(cè)工作效率。

[1]梁金姬,宋德涵,李韻辭,等.金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].山東化工,2015(10):41-42.

[2]SN/T 1895-2007 食品中金黃色葡萄球菌的快速計(jì)數(shù)法PetrifilmTM測(cè)試片法

[3]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn):GB4789.10-2016[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

[4]唐夢(mèng)君,周倩,張小燕,等.種分子生物學(xué)方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的比較研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2016(6):2247-2251.

作者簡介：胡路平（1988—），男，浙江富陽人，本科，助理工程師。研究方向：食品質(zhì)量檢測(cè)。