唐思煜，趙優(yōu)萍，吳 迪，蔡成崗，2，3，毛建衛(wèi)，2，3

(1.浙江科技學院，生物與化學工程學院，杭州310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點試驗室，杭州310023;3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310023)

桑黃(Phellinus linteus)為多孔菌科真菌火木層孔菌的子實體，是一種珍稀的食藥用真菌，隸屬于擔子菌亞門層菌綱多孔菌目多孔菌科木層孔菌屬［1-2］。該菌在中國中南地區(qū)通常生長于桑屬植物上，且其子實體為黃褐色，故名桑黃。研究發(fā)現(xiàn)桑黃含有多糖、黃酮、甾醇類物質(zhì)等多種成分［3-5］，其藥理活性物以多糖為主。目前國內(nèi)外開展了桑黃多糖的抗腫瘤、增強免疫、抗纖維化、抗氧化、降血糖、抗炎［6-11］等藥理學方面的研究。桑黃多糖主要分胞內(nèi)多糖和胞外多糖，是桑黃中主要的有效成分，具有顯著的抗腫瘤效果和其他藥用功效，值得深入研究開發(fā)［12］;它是目前國際公認的生物治癌領域中有效率排在第一位的藥用菌［13］，市場需求很大，前景較好，但桑黃野生資源稀少，人工栽培難度較大［14］，價格昂貴。采用液態(tài)深層培養(yǎng)技術進行桑黃發(fā)酵培養(yǎng)具有廣闊的前景，韓國已有桑黃的人工栽培和批量生產(chǎn)，但國內(nèi)對桑黃液態(tài)培養(yǎng)相關研究并不充分，也未成規(guī)模，且僅集中在液體發(fā)酵過程中碳、氮源等的篩選等方面［15-16］及理化因子的選擇上［17］。因此，本研究通過對菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化以期為桑黃液體深層培養(yǎng)和進一步應用提供參考。

1 試驗材料及設備

1.1 菌種及試驗材料

菌種為桑黃，由實驗室保存。試劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、牛肉膏、蛋白胨、淀粉、氯化銨、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鋅。以上試劑均為分析純，購自華東醫(yī)藥試劑公司。

1.2 儀器及設備

UV-1780紫外分光光度計，日本島津;TD4K-2離心機，湖南湘儀集團;SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，上海福瑪試驗設備有限公司;DF-101B集熱式恒溫攪拌器，金壇市國王試驗儀器廠;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海福瑪試驗設備有限公司;QYC-211全溫空氣搖床，上海?，斣囼炘O備有限公司;LDZX-40B1型立體式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;ZY-TP電子天平，浙江凱豐集團有限公司;MP511pH計，上海精密儀器儀表有限公司。

2 試驗方法

2.1 培養(yǎng)基

2.1.1 PDA 種子培養(yǎng)基

稱取200 g馬鈴薯煮沸30 min后，濾液加入葡萄糖20 g，定容至1 L，分裝30 mL于250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫備用。

2.1.2 碳源篩選培養(yǎng)基

碳源篩選培養(yǎng)基各成分的質(zhì)量濃度:KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 1.0 g/L、酵母粉 10 g/L，分別添加乳糖、淀粉、蔗糖至30 g/L，pH值自然，分裝50 mL于250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫備用。

2.1.3 氮源篩選培養(yǎng)基

氮源篩選培養(yǎng)基各成分的質(zhì)量濃度:KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 1.0 g/L、蔗糖 30 g/L，分別添加尿素、牛肉膏、蛋白胨和NH4Cl至10 g/L，pH值自然，分裝50 mL于250 mL的三角瓶，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫備用。

2.2 發(fā)酵條件

2.2.1 種子發(fā)酵條件

接種桑黃菌絲體于種子培養(yǎng)基，于28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

2.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件

用無菌槍頭移取2 mL種子液，接種于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基，并于28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d。

2.3 檢測方法

2.3.1 桑黃生物量測定

發(fā)酵結(jié)束后以4 000 r/min離心20 min，再用無菌水洗滌2次后，60℃烘干至恒重并稱重。

2.3.2 糖含量測定

還原糖含量采用DNS試劑法測定;總糖含量采用苯酚-硫酸法測定［16］;多糖以兩者差值計算。

2.4 試驗設計

2.4.1 正交試驗設計

在獲得碳、氮源試驗結(jié)果的基礎上，結(jié)合預試驗和部分參考文獻［11-14］，以碳氮質(zhì)量比、MgSO4、KH2PO4和NaCl質(zhì)量濃度為因素，分別設定為因素A、B、C、D，設計4因素3水平正交試驗，優(yōu)化發(fā)酵過程中培養(yǎng)基組成，試驗設計因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

2.4.2 生長過程分析

配制優(yōu)化后的培養(yǎng)基各成分質(zhì)量濃度:蔗糖 70 g/L，NH4Cl 10 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH值自然，250 mL三角瓶裝液量50 mL，121℃滅菌20 min，冷卻后以5%接種量接種，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，每培養(yǎng)24 h取3瓶測定菌絲體質(zhì)量，結(jié)果取3組平均值，共發(fā)酵8 d。發(fā)酵液pH值用pH計測定。

3 試驗結(jié)果與分析

3.1 標準曲線

采用DNS法測定還原糖含量，得出標準曲線方程為y=0.306 67x－0.016 48(R2=0.993 9)，還原糖標準曲線如圖1所示。采用苯酚-硫酸法檢測，以葡萄糖作為標準曲線，得出標準曲線方程為y=0.607 08x－0.029 08(R2=0.992 3)，總糖標準曲線如圖2所示。

圖1 DNS法測定還原糖標準曲線Fig.1 Standard curve of reducing sugar analysis by DNSmethod

圖2 苯酚-硫酸法測定總糖標準曲線Fig.2 Standard curve of total sugar analysis by phenol-sulphate acid method

3.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

以蔗糖、淀粉、乳糖等為碳源，考察不同碳源對桑黃菌絲體生長的影響，結(jié)果如表2所示。由表2可知，最適合桑黃生長的碳源是蔗糖。

以尿素、牛肉膏、NH4Cl、蛋白胨為氮源進行優(yōu)化，菌絲體干質(zhì)量最大的為NH4Cl，結(jié)果如表3所示。

表2 不同碳源對桑黃菌絲干質(zhì)量的影響Table 2 Effects of carbon sources on growth of Phellinus linteus

表3 不同氮源對桑黃干質(zhì)量的影響Table 3 Effects of nitrogen sources on growth of Phellinus linteus

在對碳、氮源的篩選研究中，有采用玉米粉、黃豆粉［18］作為碳、氮源，以及采用玉米粉和麥麩作為碳源，蛋白胨作為氮源進行優(yōu)化的研究［19］，得到了較好的結(jié)果，后續(xù)可結(jié)合天然有機碳源和氮源進行研究。

3.3 合成培養(yǎng)基篩選

正交試驗是在碳、氮源篩選的基礎上，結(jié)合桑黃液體發(fā)酵適宜的碳氮質(zhì)量比(A)、MgSO4(B)、KH2PO4(C)、NaCl(D)做因素水平設計，得到最適合桑黃生長的培養(yǎng)基，結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal tests

由正交試驗結(jié)果可知，蔗糖70 g、NH4Cl 10 g(碳氮質(zhì)量比 70 ∶10)，NaCl、KH2PO4、MgSO4質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.5 g/L時，對桑黃菌絲體生長最有利，在此條件下進行發(fā)酵試驗，得到菌絲體干質(zhì)量為2.814 g。

發(fā)酵液以4 000 r/min離心20 min得到菌絲體，再加蒸餾水洗滌2次后于60℃烘干，加20倍水研磨后浸提，離心取上清液用苯酚-硫酸法測總糖，還原糖用DNS法測定(表5)。

表5 正交試驗桑黃菌絲體中的糖含量Table 5 Orthogonal results of polysaccharide concentrations in mycelial biomass %

由試驗結(jié)果可知，正交試驗中第7組總糖含量最高，還原糖含量也最高，兩者之差即菌絲體多糖含量也最高，與菌絲體干質(zhì)量含量結(jié)果一致;其次為第8組。這說明還原糖含量增加有利于桑黃菌絲體多糖的積累。該方法以總糖與還原糖含量之差進行多糖含量計算，可以初步反映多糖的含量，因此有必要用寡糖含量、對標藥典等檢測方法作深入研究。

3.4 桑黃的生長周期試驗

將桑黃菌以5%接種到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，從第24 h開始測定其在培養(yǎng)192 h過程中的pH值和菌絲干質(zhì)量變化，由圖3可知桑黃在120 h時菌絲干質(zhì)量達到最大值，pH值在培養(yǎng)120 h前呈下降的趨勢，之后基本上趨于穩(wěn)定(圖4)。

圖3 桑黃菌絲體含量隨發(fā)酵時間的變化Fig.3 Change of Phellinus ligniarius mycelium growth with time of fermentation

圖4 pH值在桑黃培養(yǎng)過程中的變化Fig.4 Change of pH value in Phellinus ligniarius culture medium during fermentation

4 結(jié)論

以菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量為主要指標，對桑黃(鮑氏層孔菌)的深層發(fā)酵碳源和氮源進行了初步篩選。結(jié)果表明，最適合桑黃生長的碳源和氮源分別是蔗糖和NH4Cl，在此基礎上對桑黃發(fā)酵影響的培養(yǎng)基成分進行了三水平四因素正交試驗，進一步表明，較優(yōu)的培養(yǎng)基質(zhì)量濃度為蔗糖70 g/L、NH4Cl 10 g/L、NaCl 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L，在此培養(yǎng)基下，接種量 5%，裝液量 50 mL，培養(yǎng) 7 d 得到桑黃菌絲體2.814 g。發(fā)酵進程試驗表明，桑黃菌絲體生成量呈現(xiàn)上升趨勢，在120 h達到最高，隨后呈逐漸下降的趨勢;發(fā)酵液pH值呈逐漸下降的趨勢，發(fā)酵120 h時基本趨于穩(wěn)定。

［1］ HSIEH P W，WU J B，WU Y C.Chemistry and biology of Phellinus linteus［J］.BioMedicine，2013，3(3):106.

［2］ 張林芳，鄒莉.桑黃多糖的研究進展［J］.中國食用菌，2012，31(4):1.

［3］ WANG Y，YU J X，ZHANG C L，et al.Influence of flavonoids from Phellinus ligniarius on sturgeon caviar:antioxidant effects and sensory characteristics［J］.Food Chemistry，2012，131(1):206.

［4］ LUNG M Y，TSAI J C，HUANG P C.Antioxidant properties of edible basidiomycete Phellinus ligniarius in submerged cultures［J］.Journal of Food Science，2010，75(1):18.

［5］ ZHU T，KIM S H，CHEN C Y.A medicinal mushroom:Phellinus linteus［J］.Current Medicinal Chemistry，2008，15(13):1330.

［6］ REIS F S，BARREIRA J C M，CALHELHA R C，et al.Chemical characterization of the medicinal mushroom Phellinus linteus，(Berkeley ＆ Curtis)Teng and contribution of different fractions to its bioactivity［J］.LWT-Food Science and Technology，2014，58(2):478.

［7］ 張文雋，吳亞召，雷萍，等.秦巴山區(qū)野生桑黃rDNA ITS序列及親緣關系分析［J］.中國食用菌，2015，34(1):50.

［8］ SONG Y S，KIM S H，SA J H，et al.Antiangio genic，antioxidant and xanthine oxidase inhibition activities of the mushroom Phellinus linteus［J］.Journal of Ethnophrmacology，2003，88(1):113.

［9］ LI G，KIM D H，KIM T D，et al.Protein-bound polysaccharide from Phellinus linteus induces G2/M phase arrest and apoptosis in SW480 human colon cancer cells［J］.Cancer Letters，2004，216(2):175.

［10］ SHONE M Y，KIM T H，SUNG N J.Antioxidants and free radical scavenging activity of Phellinus baumii(Phellinus of Hymenochaetaceae)extracts［J］.Food Chemistry，2003，82(4):593.

［11］ 許謙.桑黃菌絲體黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.食品與機械，2015，31(1):190.

［12］ 丁興紅，溫成平，丁志山，等.桑黃液體發(fā)酵生產(chǎn)多糖工藝研究［J］.中草藥，2012，43(5):906.

［13］ 周新，李宏杰.黃酮類化合物的生物活性及臨床應用進展［J］.中國新藥雜志，2007，16(5):350.

［14］ 張文雋，吳亞召，雷萍，等.桑黃黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.中國食用菌，2017，36(2):52.

［15］ 邵倩，楊焱.桑黃菌絲體研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(B12):135.

［16］ RAMOS M，BELTRN A，PELTZER M，et al.Release and antioxidant activity of carvacrol and thymol from polypropylene active packaging films［J］.LWT-Food Science and Technology，2014，58(2):470.

［17］ 宋紅志，王方芹，王俊，等.桑黃菌絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng)及多糖提取和抗氧化活性測定［J］.蠶業(yè)科學，2016，42(4):700.

［18］ 傅海慶，周陽，傅華英.藥用真菌桑黃的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方優(yōu)化篩選研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學學報，2012，34(5):1039.

［19］ 許謙.生產(chǎn)桑黃三萜類化合物液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.中藥材，2016，39(12):2836.