鐘 偉，于遠望，張淑珍，李彩紅，齊 婧，尚 俊平 ，王永剛*

（1.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712002；2.陜西中醫(yī)藥大學心腦血管病研究所，陜西 咸陽 712000）

慢性心力衰竭（CHF）是各種心血管疾病終末階段的共同表現(xiàn)，再住院率和5年內(nèi)病死率居高不下，已成為急需解決的心血管病之一[1]。盡管藥物（ACEI類、β -受體阻滯劑等）和現(xiàn)代技術（心臟再同步治療、左室輔助裝置等）應用于臨床可改善患者的臨床癥狀，但大多數(shù)患者仍將走向終末期心衰[2]。近年國內(nèi)外研究[3]表明，心肌細胞能量代謝紊亂在CHF的發(fā)生與發(fā)展中起著舉足輕重的作用。當心肌缺血缺氧時，可出現(xiàn)葡萄糖、游離脂肪酸、乳酸、氨基酸等能量物質(zhì)代謝紊亂，而引起心肌細胞正常能量代謝途徑中的某個環(huán)節(jié)發(fā)生改變，導致心肌基本結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常。中醫(yī)藥具有多成分、多途徑、多靶點的作用特點，臨床防治慢性心力衰竭療效確切[4]。本實驗采用參附芎澤方干預心肌梗死后心衰大鼠，觀察其對能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～210 g，西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（陜）2012-003。

1.2 儀器與試劑 小動物呼吸機、生物組織自動脫水機、高速臺式冷凍離心機、全自動酶標儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)、電熱恒溫振蕩水槽、可調(diào)微量移液器。

ELISA試劑盒（CK、CK-MB、FFA）北京誠林生物科技有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-Actin單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；羊抗AMPK多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗GLUT-4多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；辣根酶標記兔抗山羊IgG，北京中山金橋生物技術有限公司；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，北京中山金橋生物技術有限公司；PVDF膜，美國sigma公司。

1.3 藥物 參附芎澤方（SFXZ）由丹參10 g，黨參9 g，黃芪30 g，附子6 g，川芎10 g，澤瀉15 g等組成。由陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室制備成每1 mL含生藥量1.6 g的藥液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 分組與給藥 60只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、參附芎澤方藥組、曲美他嗪組，每組15只。假手術組和模型組給予純凈水，參附芎澤方藥組和曲美他嗪組分別給予相應濃度等體積藥液，以20 mL/kg等體積溶液灌胃，1次/d，計28 d。

1.4.2 心肌梗死后心衰模型制備 大鼠稱重，采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，腹腔注射麻醉，仰臥位固定，四肢連接心電圖。氣管切開，連接小動物呼吸機。在大鼠胸骨左側(cè)第三四肋間開胸，剪開心包，暴露心臟，于肺動脈圓錐與左心耳之間，用6-0無創(chuàng)縫線在離LAD起始部2 mm處穿線結(jié)扎，局部心肌顏色變暗，心電圖Ⅱ?qū)?lián)J點或ST段抬高，關閉胸腔并縫合。術后青霉素鈉20萬U/d，腹腔注射，連續(xù)3 d。4周后，各組隨機選取2只大鼠檢測血流動力學和血清BNP，觀察模型是否制備成功。

1.5 觀察指標

1.5.1 ELISA法檢測大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量 大鼠末次給藥1 h后，腹主動脈采血，4 000 r/min，離心10 min，采集上層血清，- 80 ℃保存。ELISA檢測嚴格按照實驗說明進行操作。

1.5.2 Western blot檢測心肌組織AMPK、GLUT4蛋白的表達 取左室心肌組織100 mg，加入裂解液，離心后取上清檢測組織總蛋白。根據(jù)所要分離蛋白質(zhì)的分子量配制不同濃度的分離膠，室溫下聚合，完全聚合后，移出Teflon梳子，上下槽均加入電泳緩沖液，跑膠。PVDF膜放在漂洗過的凝膠上，0.38 A轉(zhuǎn)移膜90 min，取出PVDF膜，漂洗。置于含有10 mL用封閉液稀釋的一抗（1:200、1:200、1:500）雜交袋中，封口，過夜，漂洗，將膜放入含有10 mL用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的相應二抗（1:5 000）的雜交袋內(nèi)，封口，搖動1 h，取等體積的ECL試劑A液、B液混合，反應1 min，用保鮮膜覆蓋PVDF膜。覆蓋X線膠片，曝光。用凝膠圖像分析儀采集圖像，Western blot條帶用Image J軟件分析，結(jié)果以目的蛋白OD值與β-acting的OD值表示。

1.5.3 心肌組織HE染色 各組隨機取5只大鼠，取心臟后，縱向切取左室約0.3 cm×0.5 cm的心肌組織，4%甲醛固定，石蠟包埋切片，于光鏡下觀察心肌組織的病理改變。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析，組間比較有顯著差異進一步行q檢驗進行兩兩比較，若方差不齊采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影響 見表1。

表1 對大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影響（ ，n = 10）

表1 對大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影響（ ，n = 10）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與曲美他嗪組比較，▲ P＜0.05

組 別CK/（U/L）CK-MB/（U/L）FFA/（μmol/L）假手術組 923.42±75.67 41.82±5.73 298.37±12.48模型組 576.49±81.43# 27.43±2.81# 416.56±15.38#參附芎澤組 761.28±92.57△ 36.16±3.46△▲ 314.24±18.52△▲曲美他嗪組 784.62±87.65△ 31.08±3.82△ 362.37±17.59△

2.2 對大鼠心肌組織AMPK、GLUT4蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織AMPK、GLUT4蛋白表達均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，參附芎澤方組和曲美他嗪組大鼠心肌組織AMPK、GLUT4蛋白表達均增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與曲美他嗪組比較，參附芎澤方組大鼠心肌組織AMPK蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 對大鼠心肌組織HE染色的影響 假手術組心肌結(jié)締組織結(jié)構(gòu)清晰，心肌組織肌纖維排列整齊，連接緊密，細胞核可見，細胞核大小、形態(tài)基本一致，染色質(zhì)均勻，未見肥大、壞死、萎縮、斷裂及間質(zhì)細胞增生等現(xiàn)象；模型組心肌灶狀壞死，壞死灶內(nèi)肌纖維溶解，心肌間質(zhì)水腫，并見大量炎細胞浸潤；曲美他嗪組心肌纖維局部斷裂、排列紊亂、萎縮變性及間質(zhì)纖維組織增生程度較小，有肉芽組織的形成，壞死心肌細胞減少；參附芎澤方組心肌紊亂，心肌輕微灶狀壞死，心肌纖維溶解及炎細胞浸潤不甚明顯。

3 討論

心力衰竭屬中醫(yī)“心悸”“痰飲”“喘證”“水腫”等范疇。病機為氣虛血瘀。肺、脾、腎等功能失調(diào)，痰濕、水飲、瘀毒等病理產(chǎn)物從內(nèi)而生，共同作用于心，導致心功能受損；而心功能降低則引起痰濕、水飲在體內(nèi)集聚形成瘀毒，進一步加重臟腑功能的損傷。從而形成因虛致實，因?qū)嵵绿摚搶崐A雜的病機核心；治療以扶正祛邪為原則，強調(diào)扶正固本，以益氣活血利水為基本方法[5-8]。

心肌正常的能量代謝是維持心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和心肌舒縮功能的物質(zhì)基礎。當心肌缺血/缺氧時，心肌組織能量供應的底物發(fā)生轉(zhuǎn)換，從脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)化為葡萄糖無氧酵解為主，導致體內(nèi)FFA和乳酸堆積，心肌的能量供應不足[9-10]。同時總CK活性及構(gòu)成比會發(fā)生變化，CK同工酶內(nèi)部構(gòu)成的失衡終致總CK活性下降，從而引起能量物質(zhì)轉(zhuǎn)運發(fā)生障礙[11]。心功能降低時，機體應激性代償反應，主要通過心肌細胞的能量代謝感受器——AMP激活的蛋白激酶（AMPK）調(diào)節(jié)組織的代謝來控制能量平衡[12]，AMPK激活作用于下游靶蛋白，GLUT-4蛋白表達增多，線粒體肌酸激酶可以快速催化PCr和ADP轉(zhuǎn)化到ATP，為心肌的收縮提供能量[13]。本實驗結(jié)果表明，參附芎澤方可增加心肌組織AMPK、GLUT-4蛋白的表達和血清CK、CK-MB含量，降低血清FFA含量，調(diào)控心肌的能量代謝。

心室重構(gòu)是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，包括心肌實質(zhì)和間質(zhì)的重塑。心肌缺血不但影響細胞功能，而且可引起膠原纖維增生，心肌重構(gòu)，壞死心肌及周圍缺血心肌組織的病理學改變導致心臟的正常幾何形態(tài)改變及收縮、舒張功能降低[14]。心肌梗死后非梗死區(qū)組織膠原含量升高，可加大室壁的僵硬度，降低心室順應性，導致心室舒張功能不全[15]。本實驗HE染色結(jié)果顯示，心肌梗死后心衰大鼠心肌灶狀壞死，心肌間質(zhì)水腫，并見大量炎細胞浸潤。也從病理角度驗證了結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支建立心肌梗死后心衰模型成功。曲美他嗪和參附芎澤方給藥組可不同程度減輕心肌組織學改變。

本實驗結(jié)果表明，參附芎澤方可增加心肌組織AMPK、GLUT4蛋白的表達和血清CK、CK-MB含量，降低血清FFA含量，減輕心肌組織病理損傷，改善心衰。未來應結(jié)合蛋白組學和代謝組學探索參附芎澤方防治CHF的多靶點機制，為中醫(yī)藥臨床防治CHF提供依據(jù)。

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