盧 莉 ，劉曉芳 ，Saad Abdel r ahman ，王景雪

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.新英格蘭大學(xué)環(huán)境與農(nóng)業(yè)學(xué)院，澳大利亞 阿米代爾 2350）

鐵皮石斛為我國古老的中藥材，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《中藥大詞典》等書籍中都有記載，以莖入藥，具有益胃生津、延年益壽、滋陰、明目等功效，被國際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”[1]。鐵皮石斛植株內(nèi)有許多生物活性成分，大分子包括凝集素、細(xì)胞分裂素氧化酶、生物堿和多糖，其中，石斛多糖有免疫調(diào)節(jié)的作用[2]。生物堿有抗氧化、抗癌和神經(jīng)保護(hù)的作用；其他化合物也具有抗氧化、抗癌和免疫調(diào)節(jié)的作用[3-4]。隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，鐵皮石斛被越來越多的學(xué)者所研究，研究其中的有效成分及其發(fā)揮藥性的基因。市場上的相關(guān)產(chǎn)品多種多樣，有干制品“鐵皮楓斗”，有新鮮的石斛莖條，也有鐵皮石斛和其他中藥按一定比例制成的保健品。鐵皮石斛自然繁殖率較低，而且由于生活環(huán)境缺失、農(nóng)業(yè)的過度開發(fā)、城市化、過度采集以及醫(yī)藥的使用等原因[5-6]，導(dǎo)致野生鐵皮石斛每年的產(chǎn)量非常少。目前，野生鐵皮石斛資源接近瀕危，組培苗移栽田間往往存在成活率低的問題。另外，移栽苗對栽培環(huán)境和管理技術(shù)要求較高，栽培基質(zhì)對鐵皮石斛移栽的成活率和生長繁殖影響很大[7]，而且要求在田間生長的時(shí)間較長，因此，利用懸浮培養(yǎng)方法培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖，可為鐵皮石斛產(chǎn)品提供新的原材料[8]。

常規(guī)的鐵皮石斛組織培養(yǎng)體系是采用固體培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)方式具有簡便、容易操作、不易污染等優(yōu)點(diǎn)；但是也存在生長較慢、培養(yǎng)設(shè)施占地空間較大等弊端。而石斛原球莖懸浮培養(yǎng)具有生長周期短、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是解決石斛增殖效率低的有效途徑之一，也是近幾年研究的熱點(diǎn)[9]。史俊等[10]選用15種液體培養(yǎng)液對鐵皮石斛種子懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，得到的最佳懸浮培養(yǎng)基為：1/2 MS＋0.5 mg/L NAA＋80 g/L土豆汁＋45 g/L蔗糖。研究發(fā)現(xiàn)，相對較低的無機(jī)鹽濃度對種子的萌發(fā)有較顯著的影響，低濃度的NAA，不添加6-BA有利于原球莖的形成，不添加激素也可以誘導(dǎo)出原球莖。賈煒瓏等[11]探討康乃馨、菊花快速繁殖的培養(yǎng)基激素組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度的6-BA和適當(dāng)濃度的NAA可以有效促進(jìn)幼苗分化且移栽成活率較高。

本試驗(yàn)旨在研究一種結(jié)合懸浮培養(yǎng)和固體培養(yǎng)2種方式優(yōu)化鐵皮石斛快速繁殖的技術(shù)，以縮短鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖到再生植株成苗的組織培養(yǎng)周期，為鐵皮石斛種苗工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用種子是山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室鐵皮石斛人工授粉所得。

1.2 方法

固體培養(yǎng)條件：接種后的培養(yǎng)基放置在組培室內(nèi)，溫度25℃左右，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

懸浮培養(yǎng)條件：接種后的培養(yǎng)基放在搖床內(nèi)，轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度25℃左右，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

1.2.1 鐵皮石斛種子萌發(fā) 取人工授粉后、成熟保持新鮮且尚未開裂的蒴果（圖1-A），先沖洗干凈，再用75%的酒精、0.1%HgCl2消毒，然后用無菌水沖洗，無菌濾紙吸干水分[12]，接種于MS培養(yǎng)基上。將接種好的種子置于植物組培室進(jìn)行無菌培養(yǎng)。

1.2.2 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng) 以30 g/L蔗糖為基礎(chǔ)，采用正交設(shè)計(jì)方案，確定了4個(gè)試驗(yàn)因素：基本培養(yǎng)基、（NH4）2SO4與 KNO3的質(zhì)量比、細(xì)胞分裂素6-BA、生長素NAA，基本培養(yǎng)基為花寶一號[13]、N6和1/2 MS共3個(gè)水平，（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比分別設(shè)0.33 g/L∶0.525 g/L，0.99 g/L∶1.515 g/L，1.65 g/L∶0.505 g/L共3個(gè)水平，細(xì)胞分裂素6-BA為0.1，0.3，0.5 mg/L共3個(gè)水平，生長素NAA為0.4，0.6，0.8 mg/L共3個(gè)水平，采用L9（43）正交表，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，共9個(gè)處理。稱取0.1g原球莖接種于30mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d，每個(gè)處理接種5瓶，重復(fù)3次，每處理共15瓶。接種后的培養(yǎng)基放入搖床內(nèi)，30 d后統(tǒng)計(jì)原球莖的鮮質(zhì)量和長勢。

1.2.3 鐵皮石斛原球莖分化 以25g/L蔗糖＋6.5g/L瓊脂＋1 g/L活性炭為基礎(chǔ)，采用正交設(shè)計(jì)方案，確定了4個(gè)試驗(yàn)因素：基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素6-BA、生長素NAA、土豆汁，基本培養(yǎng)基為1/2 MS，N6，Kc共3個(gè)水平，細(xì)胞分裂素6-BA為0.1，0.2，0.3 mg/L共3個(gè)水平，生長素NAA為0.2，0.4，0.6 mg/L共3個(gè)水平，土豆汁為50，75，100 g/L共3個(gè)水平，采用L9（43）正交表，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，共16個(gè)處理。取懸浮培養(yǎng)30 d后的原球莖，用鑷子將其輕輕移入固體培養(yǎng)基中，每瓶移入6個(gè)，每個(gè)處理接種6瓶，重復(fù)3次，每處理共18瓶。接種后的培養(yǎng)基標(biāo)號放入組培室內(nèi)，60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖的鮮質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)結(jié)果在Excel上處理計(jì)算，先用Graphpad prism軟件進(jìn)行方差分析，然后進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛種子萌發(fā)

按1.2.1所述方法，用鐵皮石斛的種子誘導(dǎo)原球莖。鐵皮石斛種子接種于不添加任何植物激素的培養(yǎng)基里萌發(fā)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15 d后種子膨大、發(fā)綠，30 d后測其直徑為0.473～0.523 mm（圖1-B）。

2.2 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)

將鐵皮石斛種子固體培養(yǎng)30 d后所得的原球莖接種于液體培養(yǎng)基中增殖，研究基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素6-BA、生長素NAA和（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比對原球莖增殖的影響（表1，2）。鐵皮石斛原球莖在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后的生長情況如圖1-C所示，原球莖分化程度高，增殖效率高，但顏色有些發(fā)白。由表1可知，（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比為0.33 g/L∶0.525 g/L時(shí)在懸浮培養(yǎng)原球莖試驗(yàn)中占主要位置，4個(gè)因素對原球莖增殖率的影響大小順序?yàn)椋海∟H4）2SO4∶KNO3＞基本培養(yǎng)基＞細(xì)胞分裂素6-BA＞生長素NAA。采用方差分析進(jìn)一步驗(yàn)證得出（表 2），（NH4）2SO4與 KNO3質(zhì)量比的 F值最大，達(dá)到極顯著水平，說明（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比在原球莖增殖中影響最大；基本培養(yǎng)基也達(dá)到極顯著水平，影響力次之。

表1 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)方差分析結(jié)果

2.3 鐵皮石斛原球莖分化

將液體培養(yǎng)30 d后的原球莖接種到固體培養(yǎng)基上，研究基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素6-BA、生長素NAA、土豆對原球莖分化的影響。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖的鮮質(zhì)量，其結(jié)果如表3所示。

鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)后在固體培養(yǎng)基上生長60 d，最優(yōu)鮮質(zhì)量為4.07 g，大部分幼苗有分化現(xiàn)象，長勢良好（圖1-D）。

從表3，4可以看出，試驗(yàn)中4個(gè)因素對幼苗鮮質(zhì)量影響的主次順序?yàn)椋杭?xì)胞分裂素6-BA＞基本培養(yǎng)基＞生長素NAA＞土豆，細(xì)胞分裂素6-BA和基本培養(yǎng)基都達(dá)到了極顯著水平，在幼苗生長過程中影響很大；生長素NAA達(dá)到了顯著水平，影響力次之；有機(jī)添加劑土豆對于幼苗生長的影響力較弱。

對試驗(yàn)中各因素各水平之間的平均數(shù)進(jìn)行多重比較，以分析確定哪2個(gè)水平之間的差異顯著，結(jié)果列于表5。

由表5可知，基本培養(yǎng)基中Kc培養(yǎng)基的原球莖鮮質(zhì)量與N6培養(yǎng)基處理間有顯著性差異；細(xì)胞分裂素6-BA濃度為0.1 mg/L的原球莖鮮質(zhì)量與0.2，0.3 mg/L處理間有顯著性差異；生長素NAA的濃度為0.6 mg/L的原球莖鮮質(zhì)量與0.2 mg/L的處理間差異顯著性達(dá)到0.05水平。

表3 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)之后的固體培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)之后的固體培養(yǎng)方差分析試驗(yàn)結(jié)果

表5 各因素各水平之間平均數(shù)多重比較的結(jié)果

經(jīng)研究，篩選出鐵皮石斛不同生長階段最佳繁 殖體系如表6所示。

表6 鐵皮石斛原球莖最佳繁殖體系

3 討論

徐玲等[14]用不同有機(jī)附加物組合對鐵皮石斛原球莖鮮質(zhì)量增質(zhì)量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在培養(yǎng)60 d后，原球莖鮮質(zhì)量增質(zhì)量最高的培養(yǎng)基是MS＋0.5 mg/L NAA＋1 mg/L 6-BA＋100 g/L土豆汁＋100 g/L小麥面粉＋20 g/L蔗糖＋6 g/L瓊脂＋0.5 g/L活性炭，鮮質(zhì)量是不添加有機(jī)附加物對照的5.35倍。本試驗(yàn)中原球莖增殖采用懸浮培養(yǎng)，優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.4 mg/LNAA＋0.1 mg/L 6-BA＋0.33 g/L（NH4）2SO4∶0.525 g/L KNO3＋30 g/L蔗糖，在培養(yǎng)30 d，原球莖鮮質(zhì)量平均增殖率為6.73%。侯丕勇等[15]用不同激素對懸浮培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖在固體培養(yǎng)基上生長和分化進(jìn)行研究，結(jié)果得出，NAA對原球莖的分化作用較好，與本試驗(yàn)得出的結(jié)論生長素NAA對懸浮培養(yǎng)后原球莖增殖分化長成幼苗的影響中達(dá)到了顯著水平的結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，以種子為外植體，在固體培養(yǎng)基萌發(fā)、液體培養(yǎng)基增殖、再接種到固體培養(yǎng)基分化生根的體系，具有促進(jìn)原球莖增殖、大大增加原球莖分化率、縮短組培時(shí)間、節(jié)省生產(chǎn)空間、節(jié)約成本、生根率較高（達(dá)90.1%）等特點(diǎn)，適合大規(guī)模推廣。

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