馮倩，俞鵬，程嵩奕，曾祥偉，楊瑞，楊婧，趙鳳鳴，朱家鵬，詹秀琴(南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，南京003；南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

葛根素是提取自中藥葛根中的一種異黃酮類物質(zhì)，具有抗癌及改善心腦血管疾病、糖尿病及骨質(zhì)疏松等作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度葛根素可能通過下調(diào)miR-204及其宿主基因TRPM3表達(dá)等多種途徑提高成骨細(xì)胞增殖能力[2,3]。絲裂原活化蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，目前已知的AMPK信號(hào)通路有三條，包括經(jīng)典的AMPK信號(hào)途徑、ERK信號(hào)通路和非經(jīng)典的AMPK信號(hào)途徑(JNK/SAPK途徑和p38/AMPK途徑)，三種信號(hào)通路往往同時(shí)發(fā)揮作用，與細(xì)胞增殖、分化以及能量代謝密切相關(guān)[4]。因AMPK多在磷酸化后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，故磷酸化的AMPK(p-AMPK)表達(dá)水平對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK/微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)信號(hào)通路可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、鼻黏膜上皮細(xì)胞及多巴胺能神經(jīng)元[5～7]增殖。目前葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響及其是否與AMPK/LC3信號(hào)通路有關(guān)鮮見報(bào)道，為此我們于2017年9～11月進(jìn)行了如下研究。

1 材料

細(xì)胞：MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，0.25%胰酶消化，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。主要試劑：α-MEM 完全培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技有限公司)，葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)，β-雌二醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，兔抗鼠p-AMPK、LC3多克隆抗體、內(nèi)參β-actin一抗、Anti-Rabbit IgG二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，BCA 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，顯色劑(美國BIO-RAD公司)，siRNA-AMPK質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。主要儀器：超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素促進(jìn)細(xì)胞增殖能力的最佳作用濃度及作用時(shí)間篩選 取對(duì)數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、葛根素組和雌激素組，空白對(duì)照組每孔加入α-MEM完全培養(yǎng)基200 μL，葛根素組每孔加入葛根素與α-MEM完全培養(yǎng)基混合液200 μL，調(diào)整葛根素終濃度分別為0.1、1、10 μmol/L，雌激素組每孔加入雌激素與α-MEM完全培養(yǎng)基混合液200 μL，調(diào)整雌激素終濃度為0.01 μmol/L，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別于作用24、36、48 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8試劑，將細(xì)胞板避光置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，采用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值。結(jié)果顯示，葛根素組不同濃度作用24、36、48 h的細(xì)胞增殖能力均高于空白對(duì)照組、低于雌激素組(P均<0.05)；0.1 μmol/L葛根素作用48 h細(xì)胞增殖能力均高于同濃度作用24、36 h及1、10 μmol/L葛根素作用48 h(P均<0.05)。見表1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)葛根素組均選擇葛根素濃度為0.1 μmol/L、作用時(shí)間為48 h。

表1 各組細(xì)胞增殖能力

2.2 葛根素對(duì)細(xì)胞自噬的影響 取對(duì)數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，分為空白對(duì)照組、葛根素組和雌激素組，各組每孔均加入α-MEM完全培養(yǎng)基2 mL。葛根素組每孔加入葛根素，調(diào)整葛根素終濃度為0.1 μmol/L；雌激素組每孔加入雌激素，調(diào)整雌激素終濃度為0.01 μmol/L；每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。作用48 h，每孔加入1 mL胰蛋白酶消化并吸至1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，去上清；每管加入500 μL戊二醛，置于4 ℃冰箱中固定12 h；鋨酸再次固定，醋酸鈾染色，乙醇梯度脫水，樹脂包埋，0.1 μm厚度切片。檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察各組細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞器、細(xì)胞核和染色體形態(tài)正常；葛根素組和雌激素組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多環(huán)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，該物質(zhì)具有自噬體特異性的雙層膜結(jié)構(gòu)。表明葛根素與雌激素可誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞發(fā)生自噬。

2.3 葛根素對(duì)細(xì)胞p-AMPK、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞，參照2.2的方法進(jìn)行接種及分組處理，提取總蛋白并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取樣本25 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并剪膜后，加封閉液室溫封閉1 h。TBST漂洗5 min×3次。分別加入p-AMPK、LC3一抗(稀釋比例均為1∶1 000)4 mL，4 ℃過夜，TBST漂洗5 min×3次。加入膜與HRP結(jié)合的二抗(稀釋比例均為1∶2 000)，室溫下置于搖床孵育1 h，TBST漂洗5 min×3次。將顯色液加于濾膜正面并顯影，調(diào)整曝光時(shí)間，選擇最佳條帶。采用Bandscan分析軟件分析條帶灰度并進(jìn)行半定量分析。以目的基因條帶灰度值與管家基因β-actin條帶灰度的比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ。結(jié)果顯示，葛根素組、雌激素組p-AMPK及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均明顯高于空白對(duì)照組，雌激素組均明顯高于葛根素組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞p-AMPK、IC3-Ⅰ、IC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與雌激素組比較，#P<0.01。

2.4 干擾AMPK對(duì)葛根素作用后MC3T3-E1細(xì)胞自噬及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)的影響

2.4.1 細(xì)胞分組處理 取對(duì)數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞融合至70%時(shí)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、葛根素組和AMPK干擾組。各組每孔均加入轉(zhuǎn)染試劑與α-MEM完全培養(yǎng)基混合液2 mL。陰性對(duì)照組采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染無意義陰性序列；葛根素組及AMPK干擾組每孔加入葛根素，調(diào)整終濃度為0.1 μmol/L，AMPK干擾組采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染siRNA-AMPK質(zhì)粒。各組均培養(yǎng)4 h，更換為α-MEM完全培養(yǎng)基。

2.4.2 細(xì)胞自噬情況 各組轉(zhuǎn)染48 h，參照2.2的方法觀察細(xì)胞自噬情況。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞器、細(xì)胞核、染色體形態(tài)正常；葛根素組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多環(huán)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，該物質(zhì)具有自噬體特異性的雙層膜結(jié)構(gòu)；AMPK干擾組僅見一處自噬體特異性結(jié)構(gòu)，較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組無明顯區(qū)別。表明干擾AMPK表達(dá)可抑制葛根素介導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬。

2.4.3 細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá) 各組轉(zhuǎn)染48 h，參照2.3的方法檢測細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ。結(jié)果顯示，葛根素組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、AMPK干擾組(P均<0.01)，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、AMPK干擾組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

注：與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，*P<0.01；與葛根素組比較，#P<0.01。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特征的一類骨代謝病，成骨細(xì)胞增殖能力下降是誘發(fā)骨質(zhì)疏松的重要原因[8]。骨質(zhì)疏松癥在老年人和絕經(jīng)后婦女人群中高發(fā)，多與雌激素缺乏有關(guān)[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有類雌激素樣作用，在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、改善骨質(zhì)疏松方面具有良好的調(diào)節(jié)作用，但是其具體機(jī)制尚未明了[10]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度葛根素均可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間依賴性，其中以0.1 μmol/L葛根素作用48 h效果最佳。

自噬是將自身細(xì)胞器包裹，并通過溶酶體降解的過程，生理狀態(tài)下可以發(fā)揮提供能量、維持細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)的作用。一旦損傷超過了細(xì)胞的承受能力，細(xì)胞將通過自噬進(jìn)行調(diào)控性自殺[11]。LC3參與細(xì)胞自噬過程，細(xì)胞中新合成的LC3被加工成細(xì)胞質(zhì)可溶形式的LC3-Ⅰ，泛素化修飾后與細(xì)胞膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)化為細(xì)胞膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，是自噬標(biāo)志物，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與自噬水平呈正相關(guān)，可反映細(xì)胞自噬水平[12]。目前自噬對(duì)成骨細(xì)胞增殖水平的影響存在爭議。自噬相關(guān)蛋白7 (Atg7) 是一類自噬組成蛋白，可促使LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合，形成LC3-Ⅱ。有研究發(fā)現(xiàn)，Atg7敲除小鼠較正常小鼠的骨量降低，成骨細(xì)胞增殖能力下降[13]。此外，在成骨細(xì)胞分化的過程中，形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體數(shù)量逐漸減少，而抑制細(xì)胞自噬后則不會(huì)，表明成骨細(xì)胞自噬在一定程度上有助于骨骼穩(wěn)態(tài)和骨形成。本研究結(jié)果顯示，MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)0.1 μmol/L葛根素作用48 h后，透射電鏡下可見明顯有自噬體特異性的雙層膜結(jié)構(gòu)，表明低濃度葛根素可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞自噬而增強(qiáng)其細(xì)胞增殖能力。

成骨細(xì)胞的自噬過程涉及多條信號(hào)通路。有研究顯示，抑制ERK信號(hào)通路可降低大鼠成骨細(xì)胞的自噬水平，延緩糖尿病誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥，推測自噬對(duì)成骨細(xì)胞的不同影響可能與激活自噬的途徑有關(guān)[14]。AMPK/LC3通路是近年來自噬相關(guān)通路的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，外源性H2S可以通過AMPK/LC3通路誘導(dǎo)自噬，降低糖尿病心肌病患者的氧化應(yīng)激水平[15]。血府逐瘀湯可以通過AMPK/LC3通路上調(diào)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬水平，從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，減少心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗缺血再灌注損傷作用[16]。葛根素是否通過AMPK/LC3通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而產(chǎn)生保護(hù)作用目前鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)0.1 μmol/L葛根素作用48 h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p-AMPK蛋白表達(dá)水平上升，而干擾AMPK表達(dá)后的成骨細(xì)胞電鏡下自噬體數(shù)量減少、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯降低。表明在葛根素調(diào)控自噬參與成骨細(xì)胞增殖的過程中，AMPK/LC3通路可能發(fā)揮了正向調(diào)控作用。但細(xì)胞自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，且成骨細(xì)胞的增殖、分化、礦化對(duì)骨質(zhì)疏松均會(huì)產(chǎn)生影響[17]，需進(jìn)一步深入研究其中的分子機(jī)制。

綜上所述，葛根素可增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力；激活A(yù)MPK/LC3信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬水平是其可能的機(jī)制之一，可為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供新的治療靶點(diǎn)。

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