羅 俠

1 引言

乳菇屬(LactariusPers.)屬于紅菇科(Russulaceae)擔子菌門(Basidiomycota)，世界上該屬已描述的種約500種[1,2]。 乳菇屬真菌主要具有淀粉質(zhì)紋飾的孢子、具乳汁的子實體及子實層假囊體[3,4]. 乳菇屬目前包括三個亞屬，分別為：Lactarius、Plinthogalus(Burl.) Hesler & A.H. Sm. 和Russularia(Fr. ex Burl.) Kauffman[2,5,6]。Russularia亞屬的識別特征為菌蓋干燥，橙棕色、棕色或紅棕色，質(zhì)脆[7]。

根據(jù)已有文獻報道，中國有乳菇屬真菌130種，包括12個變種和1個變型[8,9]。但由于種種原因，中國乳菇屬分類還存在很多混亂，且實際存在的物種多樣性可能遠比這個要高，本研究通過野外調(diào)查，采用分子和形態(tài)鑒定的方法得到玉龍雪山乳菇屬一新種。

2 研究材料和方法

2.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)位于云南玉龍雪山(N26°59′-27°17′, E100°04′-100°15′)，海拔高度在2,400至5,596 m[10]。日平均溫度從1月份的6.1 °C 到7月份的18 °C ，年總降雨量大約958 mm[11]。森林植被類型為亞高山植被類型，以云杉和冷杉為優(yōu)勢樹種。

2.2 形態(tài)學研究

大型真菌子實體在野外拍照，并詳細記錄其外部形態(tài)特征，具體根據(jù)Wang 等的研究方法[9]。顏色描述根據(jù)Kornerup & Wanscher指導進行[12]，并記錄子實體乳汁顏色及其空氣中的顏色改變。

干燥樣品保存在昆明植物研究所標本館(HKAS)和泰國皇太后真菌標本館(herb. MFLU)。顯微結(jié)構(gòu)觀察和描述根據(jù)根據(jù)Heilmann-Clausen 等的方法[13]。蓋表皮和菌絲結(jié)構(gòu)在1% 剛果紅(Congo Red L4)溶液中觀察[14]。孢子在梅試劑中觀察(Melzer’s reagent)。孢子的大小和測量方法根據(jù)Wang 等的方法[9]。孢子的電子掃描照片(SEM)使用LEO/1450VP 顯微觀察拍照。

2.3 DNA提取和PCR 擴增

真菌子實體樣品核DNA提取按照試劑盒中的步驟進行(Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit (BSC14S1)，以ITS1-F/ITS4為引物擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS)片段[15,16]。 PCR反應(yīng)條件為 5 min 94 °C熱變性，接著94 °C 30 secs 35個循環(huán)，55 °C 30 secs，然后70 °C 45 secs，70 °C 7 mins延伸。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于4 °C冰箱保存。

2.4 DNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴增產(chǎn)物送北京測序公司進行正反方向測序(IOMARRY)，所得正反序列在SeqMan Pro (DNASTAR, Madison, WI)中合并和修剪。然后在MAFFTversion 7中進行多重比對[15]，并在BioEdit v. 7.0.4中對序列進行手動修剪[16]，然后在Gblocks 0.91 b中對齊并剪切掉部分質(zhì)量差的位點[17]，ITS1、5.8S 和ITS2用于系統(tǒng)發(fā)育樹分析，所有序列信息見表1。選擇L.hirtipesJ.Z. Ying, (Fr.) Fr.,L.gracilisHongo和L.glabrigracilisWisitr. & Nuytinck 三個種為外類群。最大相似性分析(Maximum likelihood (ML))在網(wǎng)站CIPRES中RAxML-HPC2 XSEDE (8.2.10)系統(tǒng)中進行[18-20]，采用GTRGAMMA 模型，1000次重復。貝葉斯分析(Bayesian analysis)在MrBayes 3.2中運行[21,22]，在MrModeltest 2.3 中通過hLRT的得到GTR+I+G 模型[23]。貝葉斯分析 (BI) 運行50,000,000代，最終得到最優(yōu)系統(tǒng)發(fā)育樹形，結(jié)果見圖1。

表1 分子系統(tǒng)發(fā)育分析采用的乳菇屬分類信息和GenBank數(shù)據(jù)

支持率左邊的數(shù)值表示最大相似性超過70%的值，右邊的數(shù)值表示貝葉斯分析超過0.85的數(shù)值，比例尺代表每個位點核苷酸變化的期望值。圖1 以ITS rDNA序列數(shù)據(jù)建立的乳菇屬真菌最大相似性系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)果

LactariusserilactiferX. Luo sp. nov. — Index Fungorum number IF552922 — Facesoffungi number FoF 03172; 圖2、圖3。

a. 擔子 b. 假囊體 c. 側(cè)生大囊體 d. 蓋表皮?！?比例尺：a-c = 10 μm，d = 20 μm。圖2 Lactarius serilactifer結(jié)構(gòu)圖

比例尺： a-b = 20 mm，c-e = 1 μm。圖3 Lactarius serilactifer子實體(a-b)照片和孢子掃描電鏡照片

語源—‘serilactifer’指的是乳液狀乳汁。

正模式標本 — 中國，云南，麗江，玉龍雪山，海拔3,490 m，云杉和冷杉混交林，N 27° 00.145, E 100° 10.230, 采集時間2015年8月18，采集人羅俠(Holotype，HKAS 94673)。

識別特征 — 子實體中型，暗棕至暖紅棕色，菌蓋表面有皺紋，水乳狀至乳白色，球形或近球形擔孢子，孢子具不完整網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，囊體稀少，蓋表皮球囊型。

菌蓋直徑50-70 mm，幼時輕微下陷，邊緣內(nèi)卷，成熟時呈下陷狀，邊緣延伸；菌蓋表面皺褶，干燥，中部黑棕色(9F6-9F4)，邊緣紅棕色(9E5-9E4)，有黑點。菌褶3-5 mm寬，具1-2 系列菌褶，延生，乳白色。菌柄65-78 × 12-16 mm，質(zhì)脆，圓柱形或向下漸粗，表面光滑，髓中空，濕潤，暗棕色(9F6-9F5)。菌肉2-4 mm厚，白色至淺橙色(5A2)，乳汁豐富，水狀至乳狀，空氣中不變色。

孢子 (6.0) 6.1-7.5 (7.7) × (5.4) 5.5-6.8 (7.0) μm, av. 6.6 × 6.2 μm, 球形至近球形，Q = 1.0-1.2 (n=35), SD =1.1 ± 0.1；紋飾高0.6至1.0 μm，疣狀凸起形成不完全網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；臍部非淀粉質(zhì)。擔子(31) 34-43 (44) × (8) 9-11 (12) μm，棒狀至近棒狀。側(cè)生大囊體少，40-50 × 6-7 μm，近紡錘形，頂端念珠狀或有短尖頭。褶緣可育，褶緣囊體少，22-51 × 4-11 μm, 近紡錘形，頂端念珠狀或尖。假囊體豐富，10-43 × 2-11 μm， 棒狀或近棒狀，有時頂端稍寬。蓋表皮球囊型，43-136 μm厚；菌絲2-7 μm寬。

生長環(huán)境— 生長在云杉和冷杉的混交林中，生長季在7月至10月。

樣品其它信息 —中國，云南，麗江，玉龍雪山，海拔3,490 m，云杉和冷杉混交林，N 27° 00.145, E 100° 10.230, 采集時間2015年8月18，采集人羅俠(Isotype, MFLU 16-2751)。

4 討論

Lactariusserilactifer屬于Russularia亞屬，這個種的主要識別特征為黑棕至紅棕色菌蓋，菌蓋表面褶皺，乳白色乳汁，孢子具不完整紋飾，囊體少，蓋表皮球囊型。分子系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果得出，該新種明顯區(qū)別于其它種，且具有很高的支持率(99/1)。該種從形態(tài)上與L.hepaticusPlowr.相似，但是該歐洲種區(qū)別于L.serilactifer的主要特征有乳汁逐漸變?yōu)辄S色，蓋表皮柵欄型[13]。該新種也與L.sphagneti(Fr.) Neuhoff相似，但后者菌蓋淺白色且邊緣具鋸齒，孢子具完整網(wǎng)狀紋飾，蓋表皮粘柵欄球囊型[13]。

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