吳海燕 黃勍棟 唐婷玉 李志軍 郝建 馬宏昊

隨著社會工業(yè)化的發(fā)展，爆炸事故頻頻發(fā)生，從2013年青島、2015年天津，到2017年杭州，每次爆炸事件均有不同程度的人員傷亡。動物實驗及臨床經(jīng)驗證實爆炸沖擊波對人體損傷的靶器官主要為肺組織、鼓膜和胃腸道[1]。水下爆炸對生物的殺傷效應強，肺部損傷發(fā)生率高，病死率高，臨床上急性肺損傷（ALI）病死率可高達35%～40%[2]。烏司他丁作為一種蛋白酶抑制劑，可以抑制多種酶的活性，減少各種炎癥因子的生成和釋放，從而保護肺組織[3-4]。本研究通過水下爆炸建立兔ALI模型，并給予烏司他丁干預治療，觀察兔血清、肺泡灌洗液（BALF）的炎癥指標變化，探討烏司他丁對兔ALI保護作用及機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康清潔新西蘭兔40只，雌雄不限，體重（2.0±0.5）kg，由安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司提供；合格證號：SYXK（皖）2007-002，自由喂養(yǎng)，給予正常飲食飲水。烏司他丁注射液（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司），DNM-9602酶標分析儀（北京普朗公司），兔核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）ELISA 試劑盒、兔TNF-α ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），兔IL-6 ELISA試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 按照隨機數(shù)字表法將兔分為正常對照（N）組、ALI(A)組、烏司他丁低劑量(B)組、烏司他丁高劑量（C）組，每組10只。所有兔稱重，做好分組標記。

1.2.2 模型制備 實驗前予禁食12h、禁水4h。于左側氣管旁作一反“L”形切口，充分暴露頸總動脈和頸外靜脈，放置24G套管針并固定；胸部脫毛，固定于自制木板上。將木板置于鋼質兔箱中，兔箱一側設置有粘貼塑料薄膜的U型缺口，調(diào)節(jié)實驗兔胸部與缺口大小一致。木板背面通過泡沫支撐與兔箱固定，以及泡沫緩沖作用，保護頭頸部、四肢等部位，兔箱示意圖見圖1。爆炸裝置及實施全程由中國科技大學近代力學系專業(yè)人員研制、操作，依據(jù)預實驗結果及力學相關公式設定爆炸劑量1.0g，爆炸距離1.8m，采用標準雷管（專利號：ZL200710019659.1），爆速 8 600m/s，爆溫（3 400±400）K，爆熱6.28 MJ/kg。爆炸裝置示意圖見圖2。A、B、C組分別進行爆炸試驗，起爆后，立即取出兔并實施簡單的急救，清理呼吸道分泌物，檢查并縫合胸壁破口，做好保暖措施，觀察記錄實驗兔的一般表現(xiàn)、精神狀態(tài)、應激反應等。各組兔均模型制作成功，予不同劑量的烏司他丁注射液（溶于0.9%氯化鈉注射液）經(jīng)頸外靜脈套管針緩慢注射，B、C組分別注射2.5、10×104U/kg烏司他丁注射液5ml，N、A組注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.3 檢測指標

1.3.1 血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平測定 爆炸后，予氯胺酮40mg/kg肌肉注射麻醉固定，分別于0、4、12、24h 采集靜脈血 5ml，室溫下離心（3 000r/min，10min），上清液于-80℃保存待用。按試劑盒說明書ELISA法檢測。

圖1 兔箱示意圖

圖2 爆炸裝置示意圖

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示。方差齊性檢驗采用Levene檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兔的一般情況 實驗前安靜環(huán)境中，所有兔呼吸平穩(wěn)，活動自如，自由飲食飲水。爆炸致傷后，A、B、C組兔表現(xiàn)為呼吸頻率加快，口唇發(fā)紺，口鼻腔黏膜充血、少量泡沫狀分泌物，伴煩躁不安、呼吸窘迫等癥狀，部分家兔短暫性昏迷。

2.2 肺組織病理學改變

2.2.1 大體表現(xiàn) N組肺組織表面呈粉紅色，無破損病

1.3.2 BALF中NF-κB、TNF-α、IL-6水平測定 爆炸后24h收集左肺BALF，采用氯胺酮40mg/kg肌肉注射麻醉固定，開胸分離氣管和雙側肺葉，仔細剔除肺外組織后結扎右肺，自制灌洗針插入左主支氣管并固定，左肺注入37℃0.9%氯化鈉注射液10ml，反復抽吸3次，回收BALF 量約為 6ml，室溫下離心（3 000r/min，10min），上清液于-80℃保存待用，ELISA法檢測。

1.3.3 肺濕干重比測定 經(jīng)耳緣靜脈注射空氣20ml將兔處死，開胸分離右肺中葉，0.9%氯化鈉注射液沖洗、吸去水分后稱濕重（wet weight，W），濕肺置于80℃烤箱內(nèi)72h，烘干后稱干重（dry weight，D）。計算濕干重比，公式為：W/D=濕重/干重，可反應肺組織水腫的程度。

1.3.4 肺組織病理學觀察 右肺下葉中部置于10%中性甲醛中固定48h，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變。灶，包膜光滑完整、有彈性，切面無液體溢出。A組肺組織明顯充血水腫，表面呈暗紅色，體積顯著增大，可見多發(fā)分布的片狀瘀血斑，切面及氣管有富含蛋白質的粉紅色泡沫狀液體溢出。B、C組肺組織充血水腫明顯減輕，僅少量瘀血斑，切面及氣管內(nèi)分泌物明顯減少。

2.2.2 鏡下觀察 N組肺組織結構基本正常，肺泡壁完整，肺泡腔和間質無出血、水腫及炎細胞浸潤。A組部分肺泡壁斷裂、融合，肺泡大小不均，上皮細胞受損，肺泡腔和間質可見大量紅細胞、炎癥細胞及漿液性滲出物浸潤，局部偶見透明膜，肺泡間隔明顯增厚。與A組相比，B、C組出血、水腫、炎性浸潤明顯減輕，以C組最為明顯。見圖3（插頁）。

圖3 各組兔肺組織病理學改變（HE染色，×400）

2.3 各組兔血清 NF-κB、TNF-α、IL-6水平的比較A、B、C組血清NF-κB水平，致傷4h較0h均明顯增高（均P＜0.05）。致傷12h，B、C組較A組降低，差異有統(tǒng)計學意義；B組與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。致傷24h，B、C組均較A組降低，以C組降低最為顯著（P＜0.05），其中C組致傷24h與0h比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。A、B、C組血清 TNF-α水平致傷 4h比較 0h明顯升高（均P＜0.05）。致傷 12、24h，B、C組均較A組降低，以C組降低最為顯著（均P＜0.05）。致傷4h，A、B、C組血清IL-6水平均較0h明顯升高（均P＜0.05）。致傷 12、24h，B、C 組均較 A 組降低，以 C 組降低最為顯著（P＜0.05）。C組致傷24h與0h相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1～3。

表1 各組兔不同時點血清NF-κB水平比較（ng/L）

表2 各組兔不同時點血清TNF-α水平比較(ng/L)

表3 各組兔不同時點血清IL-6水平比較（ng/L）

2.4 各組兔肺W/D及BALF中NF-κB、TNF-α、IL-6水平的比較 BALF 中 NF-κB、TNF-α、IL-6 水平，A、B、C組水平均較N組升高，烏司他丁干預后，B、C組均較A組降低，以C組降低最為顯著（均P＜0.05）。W/D與上述因子表達趨勢相同，以C組最顯著（P＜0.05）。見表4。

3 討論

同距離同質量TNT當量的水下爆炸壓力值約為空氣爆炸的200倍，其中造成生命威脅主要是爆炸產(chǎn)生的巨大沖擊波。爆炸后的沖擊波以波陣面形式向四周傳播，可對人體臟器造成嚴重損傷，輕者聽力下降、鼓膜破裂，重者肺肝脾破裂，甚至直接死亡。不同于空氣爆炸導致的ALI，水下爆炸的沖擊波具有更強的生物破壞力，如未能得到早期積極救治，肺損傷病死率可高達70%。但當前水下爆炸致傷的相關研究甚少。

NF-κB作為調(diào)控多種炎癥介質轉錄的核心[5]，作用于下游基因，表達并釋放TNF-α、IL-6，導致炎癥反應無限擴大，進而作用于肺毛細血管內(nèi)膜，使其通透性增高、通氣/血流比例失調(diào)。臨床上則表現(xiàn)為肺充血水腫、低氧血癥等。若未能進行早期有效干預，病死率明顯升高。全氟異丁烯（PFIB）吸入引起的大鼠肺損傷，炎癥因子通過NF-κB信號通路表達增加并釋放入血[6]。膿毒血癥導致的急性肺損傷時肺組織內(nèi)炎癥指標的表達明顯上升，而急性重度膿毒血癥導致的急性肺損傷中，NF-κB p65活性表達與肺損傷嚴重程度呈正相關[7]，多項動物模型實驗證實NF-κB信號途徑的激活可能是ALI的發(fā)病機制。炎癥因子激活NF-κB信號途徑，下游基因TNF-α、IL-6的持續(xù)表達，導致炎癥反應及肺損傷加重。也有研究顯示[8]LPS誘導產(chǎn)生ALI中，小鼠的肺泡灌洗液NF-κB、TNF-α、IL-6 表達水平均較高，與 Xiao 等[9]研究結果一致。本實驗通過水下爆炸建立小鼠急性肺損傷模型，測得A組爆炸后4、12、24h血清炎癥因子，以及肺泡灌洗液中NF-κB、TNF-α、IL-6均較爆炸前表達水平升高。

表4 各組兔肺W/D及BALF中NF-κB、TNF-α、IL-6、水平比較

直接或間接的危險因素導致的ALI發(fā)病機制可能是炎癥的過度反應。針對高發(fā)生率、高病死率，臨床上治療手段包括肺保護性通氣，機械通氣，體外膜肺氧，糖皮質激素及其他藥物治療，但尚無確切有效的方法。通過抑制NF-κB活性能夠緩解ALI嚴重程度，下調(diào)TNF-α、IL-6。無論是動物實驗中抑肽酶減輕肺損傷的嚴重程度[6]，還是甲潑尼龍、地塞米松在急性肺損傷的治療作用[10-11]，均提示通過抑制NF-κB信號途徑來減輕肺部炎癥。而蛋白酶抑制劑烏司他丁在空氣爆炸引起的急性肺損傷的動物模型中起到抑制炎癥反應，減輕肺水腫的作用，同時膿毒血癥、LPS誘導產(chǎn)生的急性肺損傷中也有類似報道[7，12]。本實驗建立兔急性肺損傷模型后分別給予高、低劑量的烏司他丁干預治療，測得4、12、24h血清炎癥因子及24h BALF中炎癥因子表達水平均較N組下降，提示治療有效，且高劑量治療C組較低劑量B組炎癥因子表達水平低；以及鏡下病理及肺W/D提示治療后肺水腫較對照組好轉，提示烏司他丁治療可以抑制肺部炎癥反應，減輕肺水腫，高劑量治療組效果更顯著。

綜上所述，水下爆炸引起的急性肺部損傷與炎癥的過度反應有關，蛋白酶抑制劑烏司他丁可以減少炎癥因子的表達釋放，減輕肺部炎癥和肺水腫，起到輔助治療的作用，為臨床中水下爆炸致ALI的治療提供實驗依據(jù)。仍需進一步研究并探討確切的發(fā)病機制，期待有學者能提出更好的治療方案。

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