段建文 陳永勝 吳雯斐 張啟瑜 熊聰

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，手術(shù)治療是唯一能達(dá)到根治標(biāo)準(zhǔn)的方法。但由于肝癌細(xì)胞具有高度侵襲轉(zhuǎn)移性，部分類型肝癌術(shù)后極易復(fù)發(fā)，使得肝癌的治療難度加大[1]。我國(guó)肝癌患者大多合并乙型肝炎后肝硬化，肝星狀細(xì)胞的活化被證實(shí)是肝纖維化的重要環(huán)節(jié)[2]。本研究將肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基與人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞間接共培養(yǎng)，應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)、Western blot等方法，探討肝星狀細(xì)胞對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、侵襲的影響及可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、人正常肝細(xì)胞株LO2、人肝星狀細(xì)胞株LX-2均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自索萊寶北京公司；CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司；FBS、1640培養(yǎng)液、PBS均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coring公司；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、核因子κB（NF-κB）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP-2）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、人正常肝細(xì)胞株LO2及人肝星狀細(xì)胞株LX-2接種于含10%體積分?jǐn)?shù)FBS的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)1～2d換液1次，按1:3消化傳代，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后收集條件培養(yǎng)基。

1.2.2 條件培養(yǎng)基制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝星狀細(xì)胞LX-2、正常肝細(xì)胞LO2，分別制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，取1ml細(xì)胞懸液于75ml培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h后收集上清液，離心過(guò)濾掉細(xì)胞碎片，并更換新的含1%FBS的1640培養(yǎng)液15ml，分別收集24、48、72h條件培養(yǎng)基，分別記為HSC-CM、LO2-CM，用以培養(yǎng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至密度為5×104/L；接種于96孔培養(yǎng)板，各取5個(gè)復(fù)孔，每孔加100μl細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，吸去上清液后分別加入100μl制備的HSCCM、LO2-CM及1%FBS 1640培養(yǎng)液，記為HSC-CM組、LO2-CM組（陰性對(duì)照）、1%FBS組（空白對(duì)照），分別培養(yǎng) 24、48、72h；每孔加入 CCK-8 10μl后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處分別檢測(cè)24、48、72h各孔吸光度（OD值），OD值越大代表增殖能力越強(qiáng)。

1.2.4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 取Transwell小室12孔板，HSC-CM組上層加入2×104個(gè)SMMC-7721細(xì)胞及 HSC-CM 200μl，LO2-CM 組 上 層 加 入 2×104個(gè)SMMC-7721 細(xì)胞及 LO2-CM 200μl，1%FBS 組上層加入 2×104個(gè)SMMC-7721細(xì)胞及1%FBS 1640培養(yǎng)液200μl，各組下層均加入含15%FBS的1640培養(yǎng)液600μl；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，棄上層小室內(nèi)液體，用甲醇棉簽拭去未透膜細(xì)胞，下室面細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色10min后，細(xì)胞于顯微鏡下（×400）計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野，取平均值，穿膜細(xì)胞數(shù)越多代表侵襲能力越強(qiáng)。

1.2.5 PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2 蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot法。各組分別培養(yǎng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞48h后，加含苯甲基磺酰氟(PMSF)的PBS刮取細(xì)胞，離心后加RIPA裂解液，超聲裂解提取細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算上樣量；制8%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）膠，上樣后以60mV恒壓跑膠至樣品進(jìn)入分離膠后，改為110mV恒壓至電泳結(jié)束；根據(jù)目的蛋白的分子量大小切膠，以350mA恒流濕轉(zhuǎn)膜90min，使目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；用5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃過(guò)夜孵育，所用一抗?jié)舛葹?:1 000稀釋；TBST洗3次，每次10min后，加5%脫脂奶粉配制二抗，常溫下孵育1h后，TBST洗3次，每次10min，于暗室中加ECL發(fā)光劑發(fā)光，曝光。目的蛋白與β-actin的灰度比值代表目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞共培養(yǎng)前后形態(tài)的變化；比較HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力及 PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2 蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的變化共培養(yǎng)前，肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例失調(diào)，見(jiàn)多個(gè)核分裂象；培養(yǎng)后，HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞核質(zhì)比失調(diào)比例增大，異常核分裂象較前明顯增多，且隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，此趨勢(shì)逐漸明顯。

2.2 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較 見(jiàn)表1。

表1HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較（OD值）

由表1可見(jiàn)，共培養(yǎng)24、48、72h后，HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LO2-CM組、1%FBS組比較，HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（均P＜0.05）；LO2-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力較1%FBS組增強(qiáng)（P＜0.05）。

2.3 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力比較 見(jiàn)表2。

表2 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力（穿膜細(xì)胞數(shù)）比較（個(gè)）

由表2可見(jiàn)，HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與 LO2-CM 組、1%FBS組比較，HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)（均P＜0.05）；LO2-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力較1%FBS組增強(qiáng)（P＜0.05）。

2.4 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞 PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2 蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1-5。

圖1 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞 PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2 蛋白電泳圖比較

圖2 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)水平比較（與1%FBS組比較，*P＜0.05；與LO2-CM 組比較，△P＜0.05）

圖3 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平比較（與1%FBS組比較，*P＜0.05；與LO2-CM 組比較，△P＜0.05）

圖4 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)水平比較（與1%FBS組比較，*P＜0.05；與LO2-CM 組比較，△P＜0.05）

圖5 HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌SMMC-7721細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)水平比較（與1%FBS組比較，*P＜0.05；與LO2-CM 組比較，△P＜0.05）

由圖1-5可見(jiàn)，HSC-CM組、LO2-CM組、1%FBS組肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞 PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與 LO2-CM組、1%FBS組比較，HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞 PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05）；LO2-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞 PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2 蛋白表達(dá)水平較1%FBS組亦均上調(diào)（均P＜0.05）。

3 討論

正常肝組織中靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞貯存體內(nèi)80%的維生素A；當(dāng)肝臟受到物理、化學(xué)、生物等因素的刺激后，肝星狀細(xì)胞被激活，構(gòu)成腫瘤間質(zhì)的主要成分，間質(zhì)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤新生血管形成等，促進(jìn)腫瘤實(shí)質(zhì)的生長(zhǎng)；實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的共同作用是肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要基礎(chǔ)[3]。目前關(guān)于活化的肝星狀細(xì)胞在原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制研究也主要局限在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和血小板衍生因子（PDGF）等方面[4]。Mikula 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組裸鼠皮下共移植正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組中共移植活化肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞更易形成腫瘤，且實(shí)驗(yàn)組中肝癌細(xì)胞侵襲力更強(qiáng)。本研究主要通過(guò)體外間接共培養(yǎng)，觀察了肝星狀細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，旨在探究其可能機(jī)制。

惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素的序貫過(guò)程，腫瘤細(xì)胞首先突破細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜，才能向鄰近組織及遠(yuǎn)處臟器浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[6]。MMP家族是惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中最重要的蛋白水解酶，不僅能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，而且能促進(jìn)腫瘤新生血管形成，維持腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)定，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[7]。其中，Ⅳ型膠原酶（MMP-2和MMP-9）與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切[8]；研究發(fā)現(xiàn)具有侵襲表型的肝癌細(xì)胞系能產(chǎn)生和活化高水平的MMP-2[9]。本研究通過(guò)Transwell侵襲試驗(yàn)，肝癌SMMC-7721細(xì)胞與HSC-CM間接共培養(yǎng)48h后發(fā)現(xiàn)，穿膜細(xì)胞數(shù)較LO2-CM組、1%FBS組增加，MMP-2蛋白的表達(dá)水平也較與LO2-CM組、1%FBS組上調(diào)。這提示肝星狀細(xì)胞可能是通過(guò)上調(diào)MMP-2的表達(dá)從而加強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

NF-κB幾乎存在于所有細(xì)胞中，是多種信號(hào)通路的交匯點(diǎn)。NF-κB主要通過(guò)抗凋亡、促增殖和免疫激活等功能促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展；其中NF-κB／Rel家族在HBV和HCV介導(dǎo)的肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，國(guó)人肝癌患者中80%合并HBV感染，NF-κB能激活炎癥反應(yīng)，激活后導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平增加（如TNF-α、IL-1β 等），炎癥介質(zhì)又正反饋調(diào)節(jié) NF-κB，由此引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，為肝細(xì)胞癌的發(fā)展提供潛在的微環(huán)境[10]；NF-κB通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附與血管生成等相關(guān)蛋白（VEGF及MMPs）轉(zhuǎn)錄結(jié)果的表達(dá)，影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，通過(guò)上調(diào)NF-κB的活性可發(fā)現(xiàn)MMP-2等因子的表達(dá)明顯上調(diào)，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)[11]。

本研究采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，與LO2-CM組、1%FBS組比較，HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；Western blot結(jié)果顯示HSCCM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞NF-κB及PCNA蛋白的表達(dá)水平也較LO2-CM組、1%FBS組明顯上調(diào)，這與Thomas等[12]研究結(jié)果一致。筆者猜測(cè)活化的肝星狀細(xì)胞對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響主要通過(guò)調(diào)節(jié)特定信號(hào)通路過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，改變相應(yīng)蛋白，如NF-κB、PCNA等的表達(dá)水平，最終實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與抑制凋亡的雙重干預(yù)效應(yīng)。這與Thomas等[12]研究結(jié)果一致。肝癌主要為富血供腫瘤，VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的促進(jìn)腫瘤新生血管形成的血管生成因子[13]。肝癌細(xì)胞大量增殖，擠壓腫瘤間質(zhì)，使間質(zhì)內(nèi)微血管受擠、阻塞，局部血管缺氧，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌VEGF等血管生成因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生；內(nèi)皮細(xì)胞能分泌大量的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，腫瘤局部微血管密度增高，為腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲提供充足的能量。腫瘤新生血管形成過(guò)程一旦啟動(dòng)，便不受機(jī)體制約，無(wú)限制地增生[14]。本研究通過(guò)CCK-8增殖及Transwell侵襲試驗(yàn)，顯示出肝星狀細(xì)胞能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)其侵襲能力；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSC-CM組肝癌SMMC-7721細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平較LO2-CM組、1%FBS組上調(diào)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，活化的肝星狀細(xì)胞可促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為，其作用機(jī)制可能與上調(diào) PCNA、VEGF、NF-κB、MMP-2表達(dá)水平有關(guān)。

[1]肖蕾,楊穎,毛睿,等.用于肝癌診斷和預(yù)后的新型腫瘤分子標(biāo)志物[J].癌癥進(jìn)展,2012,10(2):141-144.

[2]Atzori L,Poli G,Perra A.Hepatic stellate cell:a star cell in the liver[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,4l(8-9):1639-1642.

[3]Witz IP,Levy-Nissenbaum O.the tumor microenvironment in the post-PAGET era[J].Cancer Lett,2006,242(1):1-10.

[4]Yoshida K,Matsuzaki K.Differential regulation of TGF-beta/Smad signaling in hepatic stellate cells between acute and chronic 1iver injuries[J].Front Physiol,2012,3(3):53.

[5]Mikula M,Proell V,Fischer AN,et al.Activated hepatic stellate cells induce tumor progression of neoplastic hepatocytes in a TGF-β dependant fashion[J].J Cell Physiol,2006,209:560-567.

[6]Edge SB,Byrd DR,Compton CC,et al.AJCC cancer staging manual[M].7th ed.New York:Springer,2010.

[7]Bauvois B.New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers：Outside-in signaling and relationship to tumor progression[J].Biochim Biophys Aeta,2011,1825(1):29-36.

[8]Yeh HC,Lin SM,Chen MF,et al.Evaluation of serum matrix metalloproteinase (MMP)-9 to MMP-2 ratio as a biomarker in hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology,2010,57(97):98-102.

[9]Giannelli R,Bergamini C,Fransvea E,et al.Human hepatocellar carcinoma(HCC)cells require both alpha3 betal integrin and matrix metalloproteinases activity for migration and invasion[J].Lab Invest,2001,81(4):613-627.

[10]Vallabhapurapu S,Karin M.Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system ［J］.Ann Rev Immunol,2009,27(1):693-733.

[11]胡海燕,鄒典斌,孫惠,等.NF-κB與腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2003,15(5):293-298.

[12]Thomas A,Frauke B,Thilo S,et al.Blackwell Publishing Asia Activated hepatic stellate cells promote tumorigenicity of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Sci,2009:1-8.

[13]Davies EJ,Blackhall FH,Shanks JH,et al.Distribution and clinical significance of heparin sulfate proteoglycans in ovarian cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10(15):5178-5186.

[14]Kerbel RS.Tumor angiogenesis:past,present and the near future[J].Carcinogenesis,2000,21(3):505-515.