李文亮，王海立，高肖芳，楊瑞馥，倪斌，韓延平

1.江蘇大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京 100071；3.軍委裝備發(fā)展部 原亞運(yùn)村門(mén)診部，北京 100012

隨著航天科技的迅猛發(fā)展，人類(lèi)活動(dòng)進(jìn)入地外空間的同時(shí)，微生物也伴隨各種航天器及人體自身進(jìn)入太空，空間微生物學(xué)研究隨之興起。美國(guó)和俄羅斯等國(guó)家已經(jīng)開(kāi)展了一系列空間微生物的研究，而我國(guó)在該領(lǐng)域尚處于起步階段。但隨著我國(guó)航天飛行時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，在相對(duì)封閉狹小的航天器內(nèi)，航天員的感染風(fēng)險(xiǎn)逐漸升高[1]，于是空間微生物學(xué)的研究越來(lái)越受到國(guó)家的重視。有研究表明，地外空間中特殊的環(huán)境使得微生物在進(jìn)入太空后會(huì)發(fā)生一系列生理改變，包括一些致病因子及毒力、生物膜等。地外空間中的哪些因素會(huì)導(dǎo)致此種改變？地外空間存在真空、微重力、宇宙輻射、極端溫度等極端生存條件，但是借助于航天器的保護(hù)，航天活動(dòng)中微生物的生理活動(dòng)主要受微重力影響。目前，多項(xiàng)研究結(jié)果表明微重力條件下細(xì)菌生物被膜的形成能力增強(qiáng)。最初，McLean等[2]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在微重力條件下可以形成生物被膜，Crabbé等[3]也觀察到模擬微重力環(huán)境中銅綠假單胞菌形成的生物被膜樣結(jié)構(gòu)。隨后，越來(lái)越多的細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)可以形成生物被膜，其中包括肺炎克雷伯菌。

航天員體內(nèi)及航天器內(nèi)部環(huán)境中曾檢出多種致病菌及機(jī)會(huì)性致病菌，包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等[4]。本研究中的肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705株是腸桿菌科克雷伯菌屬的一種革蘭陰性桿菌，在自然界中廣泛存在，屬于機(jī)會(huì)性致病菌，且耐藥嚴(yán)重，為多重耐藥菌[5-7]。肺炎克雷伯菌1705株經(jīng)搭載神舟十號(hào)飛船后，原本短桿狀、散在分布的菌體中出現(xiàn)鏈狀排列的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)室使用美國(guó)NASA研制的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)模擬微重力（simulatedmicrogravity，SMG）[8-9]也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，并分離出不同的亞群菌株，即短桿狀的M1亞群和鏈狀排列的M2亞群[10]。在研究生物膜形成特性的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)有意思的現(xiàn)象。第一個(gè)現(xiàn)象是在SMG（低剪切力）條件下，分離到的亞群M1、M2在搖床培養(yǎng)時(shí)其生物膜形成能力存在差異[10]；第二個(gè)現(xiàn)象是在SMG環(huán)境中連續(xù)傳代培養(yǎng)后，肺炎克雷伯菌亞群菌株Ⅲ型菌毛表達(dá)能力增強(qiáng)[11-12]，這引起了我們的關(guān)注。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌生物膜的形成與其Ⅲ型菌毛密切相關(guān)[13]，而SMG具有懸浮、低剪切力的特點(diǎn)[8-9,14]，于是我們推測(cè)，不同剪切力可能使得Ⅲ型菌毛表達(dá)出現(xiàn)差異。

本研究中除了使用SMG系統(tǒng)，還用不同轉(zhuǎn)速的搖床共同組成了不同的剪切力梯度，即0（靜置）、SMG、50、100、200r/min共5種不同的剪切力，剪切力依次增高。通過(guò)不同剪切力條件下的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)，觀察Ⅲ型菌毛的表達(dá)差異，并對(duì)這種差異背后可能的分子機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705株M1亞群（簡(jiǎn)稱(chēng)肺炎克雷伯菌，本試驗(yàn)室分離保存）；酵母ATCC26603（本實(shí)驗(yàn)室保存）；LB營(yíng)養(yǎng)肉湯（Oxoid公司）；氨芐青霉素（MPBiomedicals公司）；甘露糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NH4Ac；HAc（北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司）；PureLink RNAMini試劑盒、DNA-free試劑盒、SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司）；SYBRGreenRealt?mePCRMasterMix（Toyobo公司）；熒光定量PCR儀及配套的PCR連體管（Roche公司）；旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）及高截面比容器（HARV）（Syn?thecon公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（北京六一儀器廠）；Nanodrop核酸濃度測(cè)定儀、SpeedVac抽干儀（ThermoFisherscientific公司）；透射電鏡（日立公司）；超高效液相三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津公司）。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

取肺炎克雷伯菌甘油種25μL接種于含5 mLLB液體培養(yǎng)基的大試管中，并加入5μL氨芐青霉素（100mg/mL），于37℃搖床中活化過(guò)夜，按 1∶200接種到液體培養(yǎng)基中，在 SMG、0、50、100、200r/min這5組不同剪切力條件下培養(yǎng)至相同生長(zhǎng)周期。

1.3 生長(zhǎng)曲線

取肺炎克雷伯菌甘油種25μL接種于含5 mLLB液體培養(yǎng)基的大試管中，并加入5μL氨芐青霉素（100mg/mL），于37℃搖床中活化過(guò)夜；取12個(gè)錐形瓶，各裝入18mLLB培養(yǎng)基，編號(hào)0-1、0-2、0-3、50-1、50-2、50-3、100-1、100-2、100-3、200-1、200-2、200-3；取 3個(gè) HARV 培養(yǎng)皿，注滿LB培養(yǎng)基，編號(hào)M-1、M-2、M-3；準(zhǔn)備EP管，每管加入25μL甲醛，標(biāo)號(hào)0-1-2h、0-1-4h、0-1-6h、0-1-8h等，其余各組按相同方式進(jìn)行標(biāo)號(hào)。將活化的肺炎克雷伯菌按1∶200接種于錐形瓶中，37℃培養(yǎng)，每1～2h取菌液250 μL加入含甲醛的EP管中（甲醛終濃度約為10%），立即混勻，測(cè)定菌液D600nm值并記錄。

1.4 甘露糖抑制的凝集試驗(yàn)

甘露糖抑制的酵母凝集試驗(yàn)是針對(duì)肺炎克雷伯菌M1亞群Ⅲ型菌毛設(shè)計(jì)的特異性試驗(yàn)[15]。用PBS將培養(yǎng)至相同生長(zhǎng)周期的各組肺炎克雷伯菌洗滌3次后重懸，將各組調(diào)節(jié)到相同的D600nm值，每組分別取菌液100μL滴加于6孔板板蓋上，再先后向2組菌液中加入50μL5%的D-甘露糖溶液及50μL1%酵母細(xì)胞，用槍頭混勻；將此6孔板板蓋置于定軌振蕩器上低速搖動(dòng)，3～5 min后觀察各組的凝集情況。對(duì)菌液進(jìn)行倍比稀釋后，采用相同方法進(jìn)行試驗(yàn)，觀察凝集情況，確定凝集效價(jià)。

1.5 透射電鏡觀察

用PBS將培養(yǎng)至相同生長(zhǎng)周期的各組肺炎克雷伯菌洗滌3次后重懸，與6%的戊二醛溶液1∶1混合；取混合后的菌液10μL滴在銅網(wǎng)上，后續(xù)用鉬銨酸、乙銨酸1∶1混合液進(jìn)行負(fù)染，染色3.5 min后放置過(guò)夜，待銅網(wǎng)完全干燥后用透射電鏡觀察樣品。

1.6 qRT-PCR

將 SMG、0、50、100、200r/min共 5組肺炎克雷伯菌培養(yǎng)至相同生長(zhǎng)周期，用RNA提取試劑盒分別提取各組的總RNA，在消化掉各組總RNA中殘留的基因組DNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到相應(yīng)的cDNA。

設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度為18～24bp，產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～150bp。選取肺炎克雷伯菌16SrRNA為內(nèi)參基因，對(duì)mrk基因及GGDEF基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析，比較不同剪切力環(huán)境下肺炎克雷伯菌M1亞群目的基因的表達(dá)差異。引物見(jiàn)表1。

1.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將各組肺炎克雷伯菌培養(yǎng)至相同生長(zhǎng)周期，用RNA提取試劑盒分別提取SMG、50、200r/min這3組的總RNA，通過(guò)北京諾禾致源科技有限公司的HiSeq平臺(tái)進(jìn)行三代測(cè)序，測(cè)序深度為100×。將3組兩兩組合后進(jìn)行差異分析，即SMG vs200r/min，50r/minvs200r/min，SMGvs50 r/min，并設(shè)定2組間差異表達(dá)閾值為比值大于2倍或小于0.5倍。在整體上對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析，確定其所屬代謝通路，在局部對(duì)Ⅲ型菌毛相關(guān)的mrk基因及c-di-GMP表達(dá)相關(guān)的GGDEF基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。

表1 引物及序列

1.8 c-di-GMP提取檢測(cè)

用PBS將培養(yǎng)至相同生長(zhǎng)周期的5組肺炎克雷伯菌各洗滌3次后重懸，并將各組調(diào)節(jié)到相同的D600nm值。在各組中加入由甲醇∶乙腈∶水（2∶2∶1）配置的裂解液，冰浴15min后立即放入95℃的水浴鍋中孵育10min，室溫放置10min冷卻，4℃下最大轉(zhuǎn)速離心10min，取上清。余下的菌體沉淀中加入200μL裂解液，重復(fù)上述提取過(guò)程2次，將收取的上清合并，用SpeedVac抽干儀抽干。

在測(cè)定c-di-GMP之前，加入200μLEluent A（10mmol/LNH4Ac+0.1%HAc），振蕩至充分溶解，4℃下最大轉(zhuǎn)速離心10min，取上清，用0.22 μm超濾膜過(guò)濾，采用超高效液相三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)曲線

通過(guò)觀察生長(zhǎng)曲線可知，SMG、0r/min組24 h左右到達(dá)對(duì)數(shù)后期，50r/min組18h左右到達(dá)對(duì)數(shù)后期，100、200r/min組14h左右到達(dá)對(duì)數(shù)后期。本試驗(yàn)選取對(duì)數(shù)后期的菌為研究對(duì)象，即100、200r/min組的肺炎克雷伯菌培養(yǎng)14h，50r/min組培養(yǎng) 18h，SMG、0r/min組培養(yǎng) 24h。生長(zhǎng)曲線如圖1。

2.2 Ⅲ型菌毛相關(guān)的表型試驗(yàn)

甘露糖抑制的酵母凝集試驗(yàn)中，低剪切力的SMG、0、50r/min組凝集量多，而高剪切力的100、200r/min組凝集量相對(duì)少。200r/min組的凝集量比100r/min組少，且在5組中凝集量最少（圖2）。隨后，SMG、0、50、100、200r/min各組經(jīng) 1∶5梯度稀釋后分別進(jìn)行凝集試驗(yàn)，以觀察到凝集的最大稀釋率為其凝集效價(jià)，各組凝集效價(jià)以5為底取對(duì)數(shù)后的平均值依次為6.67、5.67、5.67、4、2.67，數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA分析后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 3）。

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，低剪切力SMG、0、50r/min條件下培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌可觀察到的Ⅲ型菌毛多，而高剪切力100、200r/min組菌毛少（圖4）。

甘露糖抑制的酵母凝集試驗(yàn)和電鏡觀察兩個(gè)表型試驗(yàn)均表明，隨著剪切力的增加，Ⅲ型菌毛的表達(dá)減弱。

圖1 肺炎克雷伯菌M1亞群在不同剪切力下的生長(zhǎng)狀況

圖2 甘露糖抑制的酵母凝集試驗(yàn)

2.3 Ⅲ型菌毛相關(guān)表型實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證

圖3 不同剪切力組肺炎克雷伯菌M1亞群菌株凝集效價(jià)

針對(duì)Ⅲ型菌毛的結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)調(diào)控基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了熒光定量PCR及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。從qRT-PCR結(jié)果可以看出，與高剪切力的200r/min對(duì)比，低剪切力的SMG、0、50、100r/min組的mrkA、mrkD及mrkH表達(dá)明顯增強(qiáng)，且低剪切力的SMG、0、50r/min組表達(dá)值明顯強(qiáng)于高剪切力的100和200r/min組；SMG、50、100r/min組的mrkJ表達(dá)相對(duì)減弱；方差分析均滿足P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析，與高剪切力200r/min組相對(duì)比，50r/min、SMG組的mrkA、mrkB、mrkC、mrkD、mrkE、mrkF、mrkH、mrkI、mrkJ表達(dá)均升高，而SMG組與50r/min組相比，mrk基因的表達(dá)并無(wú)差異（表2）。

2.4 Ⅲ型菌毛表達(dá)與剪切力之間可能的分子機(jī)制探究

圖4 不同剪切力組肺炎克雷伯菌M1亞群菌株電鏡觀察

圖5 Ⅲ型菌毛相關(guān)基因qRT-PCR試驗(yàn)

表2 Ⅲ型菌毛相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

2.4.1 第二信使c-di-GMP表達(dá)水平檢測(cè) SMG、50、200r/min組c-di-GMP的平均表達(dá)水平分別為 27.15、56.3 和 84.1ng/mL。經(jīng) One-wayanaly?sisofvariance分析，P＜0.0001，隨著剪切力的升高，c-di-GMP的表達(dá)水平逐步升高（圖6）。

2.4.2 c-di-GMP相關(guān)GGDEF基因表達(dá) 在基因組完成圖中找到18個(gè)與c-di-GMP表達(dá)相關(guān)的基因，由于編碼含GGDEF基序的蛋白，故稱(chēng)為GGDEF基因。在得到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果后，將此18個(gè)基因與之相對(duì)照，發(fā)現(xiàn)了17個(gè)可以匹配的基因，其中8個(gè)基因的表達(dá)隨著剪切力的降低而顯著 上 調(diào) ，即 KPHS-06770、KPHS-17760、KPHS-27460、KPHS-29590、KPHS-38170、KPHS-39010、KPHS-39950 和 KPHS-47910（表 3）。

圖6 c-di-GMP檢測(cè)結(jié)果

在上述分析基礎(chǔ)上，根據(jù)17個(gè)GGDEF基因設(shè)計(jì)了qRT-PCR試驗(yàn)。與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)的8個(gè)表達(dá)差異較大的基因相對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨著剪切力的降低，其中7個(gè)基因在qRT-PCR試驗(yàn)中也 顯 著 上 調(diào) ，即 KPHS-06770、KPHS-17760、KPHS-29590、KPHS-38170、KPHS-39010、KPHS-39950和 KPHS-47910（圖 7）。

3 討論

為研究不同剪切力環(huán)境對(duì)肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛表達(dá)的影響，我們以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705株M1亞群為研究對(duì)象，在0、SMG、50、100、200r/min共5種不同剪切力條件下進(jìn)行了甘露糖抑制的酵母凝集試驗(yàn)和電鏡觀察表型試驗(yàn)。在甘露糖抑制的酵母凝集試驗(yàn)中，低剪切力的SMG、0、50r/min組凝集量多，而高剪切力的100、200r/min組凝集量相對(duì)少。在電鏡觀察實(shí)驗(yàn)中，低剪切力SMG、0、50r/min條件下培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌可觀察到的Ⅲ型菌毛多，而高剪切力100、200r/min組少。通過(guò)以上2個(gè)表型試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，隨著剪切力的增高，肺炎克雷伯菌M1亞群Ⅲ型菌毛的表達(dá)降低，提示低剪切力可能促進(jìn)肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛的表達(dá)。

針對(duì)肺炎克雷伯菌M1亞群Ⅲ型菌毛結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)調(diào)控基因，設(shè)計(jì)了qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。mrkA、mrkB、mrkC、mrkD、mrkE和mrkF為肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛的結(jié)構(gòu)基因，mrkH和mrkI為其正向調(diào)控基因，mrkJ為其負(fù)向調(diào)控基因[13]。從qRT-PCR結(jié)果可以看出，與高剪切力的200r/min對(duì)比，低剪切力的SMG、0、50、100r/min組的mrkA、mrkD及mrkH表達(dá)明顯增強(qiáng)，且有隨著剪切力增高，Ⅲ型菌毛相關(guān)基因表達(dá)減弱的趨勢(shì)。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析中，與高剪切力200r/min組相對(duì)比，低剪切力的SMG和50r/min組的mrkA、mrkB、mrkC、mrkD、mrkE、mrkF、mrkH、mrkI、mrkJ表達(dá)均升高，從正向驗(yàn)證了低剪切力促進(jìn)Ⅲ型菌毛表達(dá)的結(jié)論。SMG與50r/min組相對(duì)比，由于剪切力差異小，mrk基因的表達(dá)并無(wú)差異，此事實(shí)從反向驗(yàn)證了低剪切力促進(jìn)Ⅲ型菌毛表達(dá)的結(jié)論。雖然隨著剪切力的降低，負(fù)向調(diào)控基因mrkJ的表達(dá)也上調(diào)，但正向調(diào)節(jié)基因mrkH的上調(diào)更顯著，且結(jié)構(gòu)基因均表達(dá)上調(diào)，所以，qRT-PCR試驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序2種方法得到的結(jié)果具有較好的一致性，彼此共同驗(yàn)證了低剪切力促進(jìn)Ⅲ型菌毛表達(dá)的結(jié)論。

表3 17個(gè)GGDEF基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析

圖7 7個(gè)顯著上調(diào)GGDEF基因的qRT-PCR試驗(yàn)

低剪切力可以促進(jìn)Ⅲ型菌毛的表達(dá)，Ⅲ型菌毛的表達(dá)與胞內(nèi)第二信使c-di-GMP的表達(dá)水平正相關(guān)[13]，于是我們推測(cè)低剪切力組c-di-GMP的表達(dá)水平高。但是檢測(cè)結(jié)果表明，SMG、50、200 r/min組c-di-GMP的平均表達(dá)水平分別為27.15、56.3和84.1ng/mL，隨著剪切力的升高，c-di-GMP的表達(dá)水平逐步升高。這與預(yù)期觀點(diǎn)不符。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP作為一種廣泛的第二信使，其整體表達(dá)水平受很多因素影響。c-di-GMP的表達(dá)水平對(duì)表型的控制分為整體控制和局部控制，有的表型受整體c-di-GMP濃度水平的控制，而有的表型則僅受局部c-di-GMP濃度水平的控制[16]。

通過(guò)進(jìn)一步分析，我們?cè)诜窝卓死撞?705株的基因組完成圖中找到了17個(gè)c-di-GMP表達(dá)相關(guān)基因，稱(chēng)為GGDEF基因[16-17]。在得到轉(zhuǎn)錄組結(jié)果后，將此17個(gè)基因與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)差異表達(dá)較顯著的基因。隨后，根據(jù)此17個(gè)GGDEF基因設(shè)計(jì)了qRT-PCR試驗(yàn)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)的8個(gè)表達(dá)差異較大的基因相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)基因在qRT-PCR試驗(yàn)中也顯著上調(diào)。于是我們推測(cè)有可能是這7個(gè)基因中的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，造成局部的c-di-GMP表達(dá)水平增高，從而促進(jìn)肺炎克雷伯菌M1亞群Ⅲ型菌毛的表達(dá)。作為肺炎克雷伯菌的重要致病因子之一[18]，Ⅲ型菌毛在空間低剪切力的條件下表達(dá)增加，這提示在航天環(huán)境中肺炎克雷伯菌的致病能力可能發(fā)生改變，從而潛在威脅航天員的健康。

參考文獻(xiàn)