陳 婭，蔡 靜，李 勇，馬愛(ài)國(guó)

(1青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東青島 266021；2北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191)

肝毒性藥物，包括非甾體類抗炎藥、抗感染藥物、抗腫瘤藥物、激素類藥物、某些生物制劑等[1]。利福平和異煙肼作臨床治療肺結(jié)核的一線藥物，具有潛在的肝毒性。在我國(guó)，水飛薊賓已作為包括藥物性肝損傷在內(nèi)的多個(gè)指南的推薦用藥[2]。由于藥物性肝損傷的機(jī)制復(fù)雜，多是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，且保肝藥物本身也會(huì)有不良反應(yīng)，可能會(huì)加重肝臟的負(fù)擔(dān)，因此對(duì)臨床的保肝治療爭(zhēng)議不斷[1-3]。

近年來(lái)，營(yíng)養(yǎng)干預(yù)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，已有大量的研究表明，天然食品的成分中具有抗氧化、免疫、抗炎等功效。肽的市場(chǎng)前景非常大，截至2016年2月，美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了60多種多肽藥物[4]，超過(guò)400種肽療法在臨床前或臨床試驗(yàn)階段[5]。目前已經(jīng)可以從動(dòng)物、植物、微生物中提取具有生物活性的肽。海參是一種豐富的海洋資源，海參干體壁含有多種生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6-7]，它還含有多種維生素(維生素A、B1、B2、B3)和礦物質(zhì)(尤其是鈣、鎂、鐵、鋅等)[7]。海參肽是一種經(jīng)生物酶解得到的以小分子短鏈肽為主、多種功效成分共存的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，具有使用穩(wěn)定性好、便于機(jī)體的消化吸收、毒副作用小、使用安全等優(yōu)點(diǎn)，且具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗腫瘤等生物活性[8-9]。已有研究表明，海參提取物對(duì)非藥物性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，但未見(jiàn)其對(duì)藥物性肝損傷作用的相關(guān)研究。本研究擬通過(guò)利福平和異煙肼灌胃建立大鼠肝損傷模型，探討補(bǔ)充海參膠原低聚肽對(duì)利福平和異煙肼所致大鼠肝損傷的作用，為開(kāi)發(fā)海參膠原低聚肽的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

海參膠原低聚肽(SCCOPs)，淡黃色粉末，利用生物酶解技術(shù)從海參中提取的小分子生物活性肽，由吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司提供，使用時(shí)按濃度以蒸餾水配制溶液進(jìn)行灌胃。

利福平膠囊和異煙肼片，沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司；超氧化物歧化酶、丙二醛試劑盒、過(guò)氧化氫酶試劑盒、谷胱甘肽試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量測(cè)試試劑盒，南京建成生物工程研究；3K30型低溫離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；ELx808型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；7 500cx型電感耦合等離子質(zhì)譜儀，ICP-MS，美國(guó)Agilent公司；7600型全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；普通光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物及分組 SPF 級(jí)Wistar雄性大鼠72只，4w齡，體質(zhì)量200±20g，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK (魯)20140007。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為正常對(duì)照組(A)、模型組(B)、陽(yáng)性對(duì)照組(C)、海參肽低劑量組(D)、海參肽中劑量組(E)和海參肽高劑量組(F)。除A組給予0.9%生理鹽水(20mg/kg)外，其余5組分別給予異煙肼+利福平各50 mg/kg·BW，2h后，A、B組給予灌胃等體積生理鹽水，C組給予水飛薊賓22.1mg/kg·BW，D組給予SCCOPs 346 mg/kg·BW，E組給予SCCOPs 692 mg/kg·BW，F(xiàn)組給予SCCOPs 1 038 mg/kg·BW。實(shí)驗(yàn)周期為4w，所有組都喂養(yǎng)普通飼料和清水，保持籠內(nèi)環(huán)境整潔。每周稱量體質(zhì)量，并觀察大鼠生存情況。

1.2.2 樣品采集與處理 于適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，禁食12 h，斷尾取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)2w后，再次禁食12 h，斷尾取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?w實(shí)驗(yàn)結(jié)束，禁食12 h，3%戊巴比妥鈉0.3 mL/kg腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清和血漿，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。完整分離肝臟并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)。取肝臟大葉組織進(jìn)行固定用于觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)，剩余組織于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血清ALT、AST、ALP測(cè)定 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量每組大鼠血清中的谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶((AST)、堿性磷酸酶(ALP)。

1.2.4 肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及組織學(xué)評(píng)分 采用HE染色法，將肝臟用10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，HE染色，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察各組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[10-11]。

1.2.5 肝臟系數(shù) 完整分離動(dòng)物肝臟后，用生理鹽水沖洗表面血污，濾紙吸干，稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=肝重(g)/體重(g)×100

(1)

1.2.6 大鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定肝組織蛋白濃度、用丙二醛(MDA)試劑盒測(cè)定大鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化情況、用超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒測(cè)定大鼠肝勻漿抗氧化能力、用過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒測(cè)定大鼠肝勻漿抗氧化能力、用谷胱甘肽(GSH)試劑盒測(cè)定大鼠肝勻漿抗氧化能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 血清ALT、AST、ALP測(cè)定

4w實(shí)驗(yàn)后，各組大鼠血清ALT、AST、ALP變化情況見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比，模型組的血清ALT和ALP水平均升高(P<0.05)，分別升高了6.46%和17.70%，而AST水平也有升高，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；與模型組相比，海參低聚肽各劑量組和水飛薊賓組的ALT水平分別降低了28.89%、27.77%、18.56%和25.36%，ALP水平分別降低了14.84%、24.78%、21.08%和21.00%，差異均有顯著性(P<0.05)，而各干預(yù)組的血清AST水平也都有所下降，但無(wú)顯著性(P>0.05)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血漿ALT、AST和ALP水平

注：a與A組比較，P<0.05；b與B組比較，P<0.05

2.2 肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及組織學(xué)評(píng)分

4w實(shí)驗(yàn)后，HE染色結(jié)果顯示，在相同放大倍數(shù)光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠肝臟組織無(wú)損傷改變，肝索排列整齊，無(wú)炎性浸潤(rùn)；與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟組織以中央靜脈周圍的中度和重度肝細(xì)胞變性為特征，呈現(xiàn)大部分肝細(xì)胞濁腫變性，分界不清；肝小葉排列不齊，肝竇道受壓變窄；肝臟組織脂肪變性廣泛，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，海參低聚肽組與水飛薊賓組干預(yù)能顯著改善上述病變，肝細(xì)胞損傷明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)也有所恢復(fù)，肝竇道排列整齊，部分可見(jiàn)脂肪變性(附圖)。

附圖 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)A正常對(duì)照組；B模型組；C水飛薊賓組；D海參肽低劑量組；E海參肽中劑量組；F海參肽高劑量組

通過(guò)光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)肝組織切片進(jìn)行數(shù)值分級(jí)，評(píng)估肝組織損傷的病理學(xué)程度。在組織病理學(xué)檢查中，可通過(guò)觀察肝細(xì)胞壞死、脂肪變性、透明變性、氣球樣變性、Kupffer細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的范圍來(lái)評(píng)估損傷程度(表2)。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織損傷評(píng)分

注：*肝損傷通過(guò)光鏡觀察進(jìn)行評(píng)分：0分=無(wú)可見(jiàn)細(xì)胞損傷、1分=灶性肝細(xì)胞損傷小于25%的組織、2分=肝組織中25%～50%的局灶性肝細(xì)胞損傷、3分=廣泛但局限性肝細(xì)胞病變、4分=肝細(xì)胞整體壞死

2.3 肝臟指數(shù)

4w實(shí)驗(yàn)后，正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物組及低、中、高劑量組大鼠肝臟指數(shù)分別為2.86%±0.25%、3.28%±0.15%、2.86%±0.23%、2.98%±0.29%、2.83%±0.21%、2.92%±0.27%，組間有差異(P<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組相比，中高劑量組和陽(yáng)性藥物組的肝臟指數(shù)降低(P<0.05)。

2.4 大鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

4w實(shí)驗(yàn)后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝勻漿MDA平均含量升高了25.17%(P<0.05)，SOD活性降低了5.44%(P<0.05)，CAT、GSH活性也有降低，但無(wú)顯著差異(P>0.05)。與模型組相比，海參低聚肽各劑量組和水飛薊賓組MDA含量有所降低，但無(wú)顯著性(P>0.05)；水飛薊賓組的SOD、GSH活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，分別上升了14.14%、12.70%，但是中高劑量的海參低聚肽SOD活性卻降低(P<0.05)，海參低聚肽各劑量組CAT和GSH活性有所上升，但無(wú)顯著性(P>0.05)(表3)。

3 討論

抗結(jié)核藥物引起的肝毒性具有嚴(yán)重的毒副作用，且利福平和異煙肼聯(lián)用對(duì)藥物性肝損傷具有協(xié)同作用[12-14]。

表3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織MDA含量、SOD活性、CAT活性、GSH活性

注：a與A組比較，P<0.05；b與B組比較，P<0.05。MDA：丙二醛；SOD：總超氧化物氣化酶；CAT：過(guò)氧化氫酶；GSH：谷胱甘肽

本研究擬通過(guò)利福平和異煙肼灌胃建立大鼠肝損傷模型，給藥劑量參考Baskaran[15]，利福平和異煙肼的給藥劑量均定為50mg/(kg·d)。這與肺結(jié)核患者接受治療時(shí)服藥劑量相近，灌胃的方法與人類通常給藥方式相同，持續(xù)4w。

血清ALT、AST和ALP是肝損傷最常用的生化標(biāo)志物。血清轉(zhuǎn)氨酶活性一直被認(rèn)為是肝損傷的敏感指標(biāo)。肝細(xì)胞的損傷改變了它們的運(yùn)輸功能和肝細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的酶被釋放到血液循環(huán)中。因此，血清中高表達(dá)的AST和ALT表明肝細(xì)胞膜受到損害。所以肝損傷的生化結(jié)果表現(xiàn)為ALT、AST和ALP水平升高。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血清ALT、AST和ALP含量高于正常對(duì)照組，表明大鼠藥物性肝損傷模型建立成功，且模型組大鼠的肝臟出現(xiàn)了病理?yè)p傷；與模型組相比，陽(yáng)性藥物組和海參低聚肽各劑量組的血清ALT、ALP含量均有所下降?？梢?jiàn)大鼠肝功能有所改善，海參低聚肽表現(xiàn)出一定的活性。這一結(jié)果與王寅等[16]研究結(jié)果一致。

HE染色結(jié)果以及組織學(xué)評(píng)分顯示，機(jī)體長(zhǎng)期聯(lián)合用抗結(jié)核藥物可引起肝損傷，而海參低聚肽組能改善上述病變，如肝細(xì)胞腫脹、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、脂肪變性等。上述結(jié)果表明，海參低聚肽通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞和減少潛伏性、漸進(jìn)性炎癥損傷而抑制利福平和異煙肼聯(lián)用引起的藥物性肝損傷。同時(shí)，肝臟指數(shù)作為反應(yīng)肝組織腫脹嚴(yán)重程度的指標(biāo)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)升高；與模型組相比，中高劑量組和陽(yáng)性藥物組的肝臟指數(shù)降低，說(shuō)明海參低聚肽能減輕藥物性肝損傷。這與國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果一致。Esmat等[17]研究發(fā)現(xiàn)，海參提取物能夠降低大鼠硫代乙酰胺中毒引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，病理切片結(jié)果也顯示有所改善。王丹等[18]也發(fā)現(xiàn)，海參提取物對(duì)脂肪肝具有保護(hù)作用。

另外，肝細(xì)胞具有許多抗活性自由基的酶防御機(jī)制，抗氧化酶活性的測(cè)定是評(píng)價(jià)抗氧化防御狀態(tài)的一種間接方法[19]。研究發(fā)現(xiàn)，利福平和異煙肼聯(lián)用，對(duì)通過(guò)損傷細(xì)胞膜、增加脂質(zhì)過(guò)氧化作用的內(nèi)源性酶促氧化-抗氧化失衡、增強(qiáng)CYP2E1介導(dǎo)的生物活化機(jī)制而導(dǎo)致的肝毒性有協(xié)同作用，能降低SOD、CAT和GSH的活性，生成包括MDA在內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致嚴(yán)重后果[20-21]。因此，抗氧化酶在解毒方面也起著重要的作用。本次試驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，模型組的MDA含量升高，SOD、CAT、GSH活性降低，這說(shuō)明利福平和異煙肼能引起細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，細(xì)胞清除自由基的能力下降，細(xì)胞氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡。與模型組相比，水飛薊賓組與海參低聚肽各組的SOD、CAT、GSH、MDA水平均有改善的趨勢(shì)，但是改變并不顯著，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，海參膠原低聚肽可以改善利福平和異煙肼聯(lián)用所致的藥物性肝損傷，為藥物性肝損傷治療中的潛在臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。但是有關(guān)海參肽對(duì)人體保健作用的研究還比較少，其具體機(jī)制和功能學(xué)評(píng)價(jià)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討?！?/p>

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