楊賽琳 許文 林福全 周妙妮 許愛(ài)娥

310009杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院皮膚科

白癜風(fēng)是以Th1型細(xì)胞為主介導(dǎo)的疾病，γ干擾素（IFN-γ）是Th1淋巴細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一，IFN-γ與受體結(jié)合后，促發(fā)Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活物（JAK-STAT）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促動(dòng)JAKS和STAT磷酸化，誘導(dǎo)趨化因子表達(dá)［1］。趨化因子受體3及其配體CXCL9和CXCL10被認(rèn)為是在白癜風(fēng)等自身免疫和炎癥過(guò)程中促進(jìn)T細(xì)胞遷移最相關(guān)的趨化因子軸之一［2］。CXCL9、CXCL10等在白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［3-5］。在白癜風(fēng)患者血清中CXCL9和CXCL10比健康人高，血清CXCL10可能是監(jiān)測(cè)疾病活動(dòng)和指導(dǎo)進(jìn)展期白癜風(fēng)治療的新型生物標(biāo)志物［6］。與健康人相比，在白癜風(fēng)患者病灶周?chē)つw中CXCL10和IFN-γ表達(dá)增加［2］。他克莫司（tacrolimus）是一種免疫調(diào)節(jié)劑，臨床上已證明其治療白癜風(fēng)有效［7］。Tu等［1］研究表明，他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞IFN-γ相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生影響。他克莫司下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的IFN-γ受體α、磷酸化Janus激酶2（pJAK2）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（pSTAT-1）和CXCL8表達(dá)。尚未見(jiàn)他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子CXCL9、CXCL10及Janus激酶1信號(hào)途徑的影響。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western印跡法檢測(cè)他克莫司對(duì)IFN-γ刺激HaCaT細(xì)胞分泌CXCL9、CXCL10及相關(guān)信號(hào)途徑關(guān)鍵蛋白的影響，為他克莫司治療白癜風(fēng)作用機(jī)制的研究提供依據(jù)。

一、材料

他克莫司由海正藥業(yè)杭州有限公司生產(chǎn)（批號(hào)TAB0160901，純度99.1%），rhIFN-γ為美國(guó)Perpotech公司產(chǎn)品，人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT購(gòu)于上海博谷生物科技有限公司，MTT、胎牛血清為美國(guó)Gbico公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒為美國(guó)羅氏公司產(chǎn)品，CXCL9、CXCL10引物由廣州復(fù)能公司設(shè)計(jì)合成。CXCL9、CXCL10抗體、ELISA試劑盒為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品，蛋白提取試劑盒、蛋白MARK為美國(guó)Fermentes公司產(chǎn)品。

二、方法

1.MTT法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，按1×105/ml濃度接種入96孔板，每孔100 μl。用二甲基亞砜（DMSO）配制他克莫司成1 kg/L溶液，用培養(yǎng)液稀釋至1、10、20、40、60、80、100、120 mg/L，處理細(xì)胞，與空白對(duì)照組同置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。加入MTT溶液（5 g/L）10 μl/孔，4 h后棄上清液，加入DMSO 100 μl/孔，振蕩10 min，置酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度（A值）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A490/對(duì)照組A490×100%。

2.熒光定量PCR檢測(cè)CXCL9、CXCL10 mRNA表達(dá)：分為空白對(duì)照組、IFN-γ組、他克莫司組及他克莫司+IFN-γ組。根據(jù)MTT結(jié)果選擇20 mg/L他克莫司預(yù)處理HaCaT細(xì)胞4 h，用500 U/ml IFN-γ刺激細(xì)胞12 h，熒光定量PCR測(cè)定4組細(xì)胞內(nèi)CXCL9、CXCL10 mRNA含量，嚴(yán)格按試劑盒步驟操作。

3.Western印跡法檢測(cè) CXCL9、CXCL10、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)：分組同熒光定量PCR檢測(cè)。20 mg/L他克莫司處理4 h，500 U/ml IFN-γ處理48 h。收集細(xì)胞，蛋白裂解液裂解，離心后收集上清液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，每組各取50 μg總蛋白樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室溫4℃封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，洗膜后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗IgG抗體室溫孵育1 h，與ECL顯色劑以1∶1比例混合后孵育1 min，用保鮮膜包被后轉(zhuǎn)X線片曝光3 min。以β肌動(dòng)蛋白及磷酸化總蛋白為內(nèi)參照。重復(fù)3次，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白表達(dá)情況。

4.ELISA法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞上清液中CXCL9、CXCL10蛋白。分組處理同熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

5.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料采用±s，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.不同濃度他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響：0、1、10、20、40、60、80、100、120 mg/L他克莫司處理4 h后，HaCaT細(xì)胞存活率分別為100%、85%、96%、90%、67%、13%、13%、12%、13%。與空白對(duì)照組比較，40～120 mg/L他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖有明顯抑制作用（均P＜0.05）；0～20 mg/L他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCL9、CXCL10 mRNA表達(dá)的影響：與空白對(duì)照組比較，IFN-γ組能明顯增加CXCL9、CXCL10 mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與IFN-γ組比較，20 mg/L他克莫司能明顯抑制IFN-γ刺激后細(xì)胞CXCL9、CXCL10 mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

3.他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCL9、CXCL10及p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)的影響：見(jiàn)表2、圖1。與空白對(duì)照組比較，IFN-γ組明顯增加CXCL9、CXCL10及p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與IFN-γ組比較，20 mg/L他克莫司明顯抑制IFN-γ刺激后細(xì)胞CXCL9、CXCL10、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

4.他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白含量的影響：見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較，IFN-γ組明顯增加細(xì)胞培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白的含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與IFN-γ組比較，20 mg/L他克莫司能明顯抑制IFN-γ刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 20 mg/L他克莫司處理對(duì)500 U/ml γ干擾素刺激HaCaT細(xì)胞CXCL9、CXCL10 mRNA表達(dá)的影響（±s）

表1 20 mg/L他克莫司處理對(duì)500 U/ml γ干擾素刺激HaCaT細(xì)胞CXCL9、CXCL10 mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。各組與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01。各組與γ干擾素組比較，bP＜0.01

組別空白對(duì)照組γ干擾素組他克莫司組他克莫司+γ干擾素組CXCL9 1 10 369.08±7.99a5 166.6±3.01a b5 914.33±4.59bCXCL10 1 290.02±2.16a176.68±0.74a b114.96±0.73b

四、討論

白癜風(fēng)的治療是一個(gè)挑戰(zhàn)。糖皮質(zhì)激素是最常用的藥物，但長(zhǎng)期大量使用會(huì)引起皮膚萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張、多毛癥和痤瘡等。他克莫司治療白癜風(fēng)，尤其是面頸部白癜風(fēng)療效好，安全性高，長(zhǎng)期使用不會(huì)有外用糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)［8］。Lan等［9］認(rèn)為，他克莫司可通過(guò)刺激角質(zhì)形成細(xì)胞釋放干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖。Kang等［10］發(fā)現(xiàn)，他克莫司可通過(guò)刺激酪氨酸酶活性和表達(dá)來(lái)促進(jìn)黑素細(xì)胞色素生成和遷移。

本研究結(jié)果顯示，IFN-γ對(duì)CXCL9和CXCL10基因表達(dá)的影響不同，CXCL9的表達(dá)量豐度比CXCL10高，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。20 mg/L他克莫司能抑制HaCaT細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10的基因表達(dá)。CXCL9基因相對(duì)表達(dá)量減少43%，CXCL10基因相對(duì)表達(dá)量減少60%，表明他克莫司對(duì)CXCL10基因表達(dá)的抑制作用更強(qiáng)，具體原因有待進(jìn)一步研究。20 mg/L他克莫司能抑制HaCaT細(xì)胞中JAK1及STAT1磷酸化；能抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)與培養(yǎng)上清液中IFN-γ誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10蛋白表達(dá)。本研究為進(jìn)一步闡明他克莫司治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制及他克莫司的臨床應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 20 mg/L他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCL9、CXCL10、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)的影響 1：空白對(duì)照組；2：500 U/ml γ干擾素組；3：他克莫司組；4：他克莫司+γ干擾素組

表2 20 mg/L他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白表達(dá)的影響（灰度值，±s）

表2 20 mg/L他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白表達(dá)的影響（灰度值，±s）

注：n=3。各組與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；各組與γ干擾素組比較，cP＜0.01

組別HaCaT細(xì)胞空白對(duì)照組γ干擾素組他克莫司組他克莫司+γ干擾素組CXCL9 6.18±0.06 8.47±0.29b6.69±0.27a c7.36±0.13cCXCL10 7.58±0.11 7.87±0.17a7.18±0.07b c7.36±0.09cp-JAK1 2.59±0.18 4.20±0.18b1.23±0.11b c2.60±0.16cp-STAT1 2.36±0.05 4.29±0.11b2.04±0.07b c3.62±0.19c培養(yǎng)上清液CXCL9 79.59±0.27 1 213.36±0.95b699.59±0.69b c426.45±0.31cCXCL10 148.92±0.25 1 722.41±2.57b464.98±0.53b c554.12±0.56c