吳超群，李小芳，牟倩倩，嚴(yán)敏嘉，趙甜甜，馬祖兵

甘草黃酮是從甘草根及根莖中提取的一類具較強(qiáng)生理活性的脂溶性物質(zhì)，具有顯著的抗炎、抗?jié)兊人幚碜饔?，但甘草黃酮的水溶性差，嚴(yán)重制約了其的應(yīng)用及發(fā)展[1-2]。納米混懸劑(nanosuspensions NS)是 20 世紀(jì)末發(fā)展起來的一種新型納米給藥系統(tǒng)，其主要是以少量表面活性劑為穩(wěn)定劑的“純藥物”粒子構(gòu)成一種亞微米膠體分散體系[3-4]。其適用范圍廣，無論是難溶于水的藥物還是既難溶于水又難溶于油的藥物均適用。納米混懸劑因處方簡單、制備快速、載藥量高、且具有靶向性等優(yōu)勢成為增溶技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。本試驗(yàn)采用沉淀法-高壓均質(zhì)法制備甘草黃酮納米混懸劑，并采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對處方進(jìn)行優(yōu)化，以期得到工藝穩(wěn)定、處方簡單、預(yù)測性及重現(xiàn)性良好的甘草黃酮納米混懸劑。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Nicomp 380ZLS 型激光粒度分析儀 ( 美國 PSS公司 ) ；AH-100D 型高壓均質(zhì)機(jī) ( 加拿大 ATS 公司 )

1.2 材料

甘草黃酮原料藥(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)XC20160508，含有量為70.0%); 十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚維酮K30（PVPK30）、泊洛沙姆188（P188）、聚乙二醇400（PEG400）、吐溫-80(成都市科龍化工試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草黃酮納米混懸劑的制備

采用沉淀法-高壓均質(zhì)法制備。稱取甘草黃酮加入適量的無水乙醇，超聲使其完全溶解；勻速加入到含有穩(wěn)定劑的純水溶液中，勻速攪拌15 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇，即得粗混懸液，采用高壓均質(zhì)機(jī)在一定的壓力下均質(zhì)數(shù)次，即得甘草黃酮納米混懸劑。采用Nicomp 380ZLS 型激光粒度分析儀測定粒徑及PDI值。

2.2.1 穩(wěn)定劑的篩選 根據(jù)參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)[5-6]，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備甘草黃酮納米混懸劑，以平均粒徑、多分散指數(shù)（PDI）以及2 h后的穩(wěn)定性情況為評價(jià)指標(biāo)，考察了十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚維酮K30（PVPK30）、泊洛沙姆188（P188）、聚乙二醇400（PEG400）、吐溫-80等不同穩(wěn)定劑對甘草黃酮納米混懸劑的影響。見表1可知，PVPK30與PEG-400聯(lián)合作為穩(wěn)定劑時(shí)，制得的納米混懸劑粒徑小，體系能保持較長時(shí)間的穩(wěn)定。

表1 不同種類穩(wěn)定劑對甘草黃酮納米混懸劑平均粒徑和PDI的影響(n=3,±s)

表1 不同種類穩(wěn)定劑對甘草黃酮納米混懸劑平均粒徑和PDI的影響(n=3,±s)

穩(wěn)定劑種類 平均粒徑（nm） PDI 2h后的穩(wěn)定性SDS 244.3+2.780.283+0.009 細(xì)微沉淀懸浮后沉淀于杯底PVPK30 205.9+2.110.219+0.006 絮狀聚集懸浮，搖之易分散P188 298.2+4.560.327+0.015 顆粒較大，沉淀于杯底PEG400 210+2.23 0.265+0.008 極細(xì)微粒懸浮在水中吐溫-80 272.9+4.820.378+0.021 顆粒大易產(chǎn)生絮凝，再分散難SDS+PVPK30301.3+6.280.389+0.017 顆粒較大，放置后沉淀于杯底PVPK30+P188289.6+5.210.312+0.025 顆粒較大，放置后沉淀于杯底PEG-400+PVPK30 200.7+3.120.189+0.006 顆粒細(xì)小，放置后能保持較長時(shí)間的穩(wěn)定

2.3 單因素考察

2.3.1 乙醇用量考察 按“2.1”項(xiàng)下的方法制備甘草黃酮納米混懸劑，以平均粒徑及PDI為評價(jià)指標(biāo)，考察無水乙醇與水的體積比為1:10、1:5、2:1對甘草黃酮納米混懸劑粒徑和PDI的影響。見表2可知，隨著無水乙醇的用量增加，制得的甘草黃酮納米混懸劑的粒徑越小，但PDI隨之增大。因有機(jī)溶劑具有一定毒性，故選取無水乙醇與水的體積比為1:10。

表2 無水乙醇用量對甘草黃酮納米混懸劑的粒徑和PDI的影響結(jié)果(n=3,±s)

表2 無水乙醇用量對甘草黃酮納米混懸劑的粒徑和PDI的影響結(jié)果(n=3,±s)

無水乙醇：水 平均粒徑（nm） PDI 1:10 215.6±3.12 0.213±0.0161:5 196.5±2.76 0.315±0.0232:1 168.2±3.65 0.325±0.031

2.3.2 磁力攪拌器轉(zhuǎn)速考察 按“2.1”項(xiàng)下的方法制備甘草黃酮納米混懸劑，以平均粒徑及PDI為評價(jià)指標(biāo)，考察了200、400、600、800、1000 r﹒min-1五種轉(zhuǎn)速對甘草黃酮納米混懸劑的影響。見圖1可知，隨著磁力攪拌器轉(zhuǎn)速的增加，甘草黃酮納米混懸劑的粒徑及PDI隨之減小，這是由于高轉(zhuǎn)速能增加粒子間的碰撞機(jī)會(huì)以及強(qiáng)度，使得粒徑減小，但當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時(shí)，攪拌過程中可能會(huì)產(chǎn)生氣泡，阻礙了粒子間的碰撞，導(dǎo)致粒子增大[7]。故最終選取轉(zhuǎn)速為800 r﹒min-1。

圖1 磁力攪拌轉(zhuǎn)速對粒徑及PDI的影響

2.3.1 均質(zhì)壓力對粒徑及PDI的影響 按2.1項(xiàng)下的方法制備甘草黃酮粗混懸液，將其置于50 MPa的壓力下均質(zhì)3次，再分別于40、60、80、100、120、150 MPa等不同壓力下均質(zhì)10次，測定平均粒徑及PDI值。見圖2可知：隨著均質(zhì)壓力的升高，甘草黃酮納米混懸劑的粒徑及PDI值逐漸變小，當(dāng)增加到一定壓力后，又隨之增大。故選擇將粗混懸劑先在50 MPa下循環(huán)3次，再在120 MPa下循環(huán)10次。

圖2 不同均質(zhì)壓力對粒徑及PDI的影響

2.3.2 均質(zhì)次數(shù)對粒徑及PDI的影響 按2.1項(xiàng)下的方法制備甘草黃酮粗混懸液，將其置于50 MPa的壓力下均質(zhì)3次，再置于120 MPa的壓力下分別均質(zhì)5、10、15、20和25次取樣，測定平均粒徑及PDI值，見圖3可知：隨著均質(zhì)次數(shù)的增多，甘草黃酮納米混懸劑的平均粒徑及PDI逐漸降低，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)達(dá)到15次后，甘草黃酮納米混懸劑的平均粒徑及PDI值的變化不大。故綜合考慮，選擇均質(zhì)次數(shù)為15次。

圖3 均質(zhì)次數(shù)對粒徑及PDI的影響

2.4 甘草黃酮納米混懸劑的處方優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化處方 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取甘草黃酮質(zhì)量濃度（A）、PVP K30 濃度（B）、PEG-400濃度（C）為因素，以甘草黃酮納米混懸劑的平均粒徑（Y ）為相應(yīng)值，響應(yīng)值越小越好。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化甘草黃酮納米混懸劑的處方。實(shí)驗(yàn)因素水平見表3，試驗(yàn)安排與結(jié)果見表4。

表3 實(shí)驗(yàn)因素水平表

表4 Box-Behnken試驗(yàn)安排及結(jié)果

14 -1 0 1 245.215 1 -1 0 225.616 -1 0 -1 210.817 1 1 0 285.9

2.4.2 模型的擬合 應(yīng)用 Design-Expert 8.0.6 軟件分析對表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到模型的二次多元回歸方程： Y =+198.36+13.16* A+23.64*B+19.48* C+5.15* A * B+3.38* A * C-18.38* B *C+23.89* A2+24.34* B2+22.92* C2（P＜0.0001）。擬合方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9898，表明該模型擬合程度良好，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）,表明該模型無失擬現(xiàn)象，可充分反映實(shí)際試驗(yàn)值。綜上，該模型可對甘草納米混懸劑的處方進(jìn)行分析和預(yù)測。

表5 方差分析結(jié)果

2.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 根據(jù)回歸方程應(yīng)用 Design-Expert 8.0.6 軟件繪制三維效應(yīng)面圖，見圖4。可知，甘草黃酮納米混懸劑的粒徑受甘草黃酮濃度、PVPK30及PEG-400共同影響，粒徑隨著PVPK30和PEG-400的用量增加先降低后升高，隨甘草黃酮濃度的增大呈非線性增加。經(jīng)以上分析，模型預(yù)測的最優(yōu)處方為：甘草黃酮為10.14 mg﹒mL-1，PVPK30為2.26 mg﹒mL-1，PEG400為2.29 mg﹒mL-1，預(yù)測Y值為181.8。

圖4 三維效應(yīng)曲面圖

2.4.4 最優(yōu)處方驗(yàn)證 按“2.4.3”項(xiàng)下優(yōu)化所得處方，制備3批甘草黃酮納米混懸劑，測定平均粒徑及PDI值。見表5可知，預(yù)測值與實(shí)際值的偏差為1.16%，說明 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所得到的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好，適用于甘草黃酮納米混懸劑的處方優(yōu)化。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化驗(yàn)證

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)，采用 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選甘草黃酮納米混懸劑的最優(yōu)處方。以PVPK30、PEG-400為穩(wěn)定劑，采用沉淀法-高壓均質(zhì)法制備甘草黃酮納米混懸劑，得到外觀均為帶乳光的棕黃色溶液，粒徑為（179.7±0.907）nm，PDI為0.274±0.012。

4 討論

納米混懸劑制備方法主要分為了Bottom-up 技術(shù)和Top-down 技術(shù)兩大類，沉淀法即采用Bottom-up技術(shù)將藥物先溶解后通過控制析晶條件聚集成納米粒子；高壓均質(zhì)法采用Top-down技術(shù)借助機(jī)械力將藥物大顆粒粉碎成納米粒子。將沉淀法和高壓均質(zhì)法聯(lián)合使用，不僅降低了高壓均質(zhì)機(jī)堵塞狹縫的風(fēng)險(xiǎn)，防止其因硬度過大不易均質(zhì)，且克服了沉淀法制得產(chǎn)品不均勻，易團(tuán)聚的問題[8-9]。

納米混懸劑屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，粒子易發(fā)生聚集以減小表明自由能。為克服粒子間的聚集，通常需加入適量、適宜的穩(wěn)定劑。PVP K30是一種常用的空間穩(wěn)定劑，提供立體穩(wěn)定效應(yīng)[10-11]。本研究采用PVPK30與PEG-400 聯(lián)合作為穩(wěn)定劑制備甘草黃酮納米混懸劑。

應(yīng)用Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化甘草黃酮納米混懸劑處方是基于單因素試驗(yàn)，可充分考慮到各個(gè)因素之間的交互作用，并對其進(jìn)行非線性模型擬合，具有可信度高、預(yù)測性好等優(yōu)點(diǎn)。

[1]伍衛(wèi)平, 孫文基.甘草黃酮類化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn), 2004, 5(1):10.

[2]劉洋, 金玉姬, 吳湘軍,等.甘草黃酮的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2014(2):135.

[3]Shen BD, Jin S, Yu C, Yue PF, Han J, Yuan HL.Enhanced intestinal absorption activity and hepatoprotective effect of herpetrione via preparation of nanosuspensions using pH-dependent dissolving-precipitating/homogenization process [J].Pharm Pharmacol, 2013, 65(9): 1382.

[4]朱建芬, 吳祥根.納米混懸劑的制備方法及其在藥劑學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2006, 37(3): 196-199.

[5]武娜, 張利紅, 程玲,等.金絲桃苷固體納米晶體的制備及其體外釋放研究[J].中草藥, 2015, 46(12):1759.

[6]羅開沛,李小芳,楊露,等.水飛薊素納米混懸劑的制備及體外溶出[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2016,47(9):1165.

[7]Vijay A,,Meenakshi B.Investugation of Formulation and Process Parameters for the Production of Esomeprazole Nansuspension by Anti-solvent Prcipitation Ultasonication Technique[J].Current Nanoscience,2013,9(6):773.

[8]Zhao YX,Hua HY,Chang M, et al.Preparation and cyto-toxic activity of hydroxycamptothecin nanosuspensions[J]Int J Pharm, 2010,392(1-2):64.

[9]袁慧玲, 易加明, 張彩云,等.納米混懸劑的制備方法及給藥途徑研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志, 2014(3):297.

[10]Van Eerdenbrugh B, Vermant J, Martens JA, et al.A screening study of surface stabilization during the production of drug nanocrystals [J].J Pharm Sci, 2009, 98(6): 2091.

[11]岳鵬飛,王 勇,萬 晶, 等 .固體納米晶體給藥系統(tǒng)構(gòu)建方法的研究進(jìn)展 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(9): 1120.