李亞玲，張繼，陳洪燕，李玲，張世波（.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥學部，四川瀘州646000；.中國食品藥品檢定研究院中藥標本館，北京 00050；.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部，烏魯木齊 80000；4.瀘州市中醫(yī)院藥劑科，四川瀘州 646000）

川貝（Fritillariae cirrhosaeBulbus）是川產(chǎn)道地常用名貴中藥，具有“止咳圣藥”之稱[1]，其用藥歷史悠久、療效顯著、開發(fā)價值高且市場需求大。由于用藥歷史、產(chǎn)地、商品交易等原因，川貝的商品規(guī)格等級復雜繁多，2015年版《中國藥典》（一部）按性狀不同將川貝分為松貝、青貝、爐貝和栽培品4個商品規(guī)格，其中松貝具有“懷中抱月”“觀音坐蓮”“蒜泥蒂”等性狀鑒別特征，青貝具有“觀音合掌”“開口笑”等性狀鑒別特征[2]。藥材的商品規(guī)格等級被認為是藥材品質(zhì)的外在表現(xiàn)[3]，市場價格也是按藥材的商品規(guī)格等級而定。傳統(tǒng)一直認為川貝個體越小質(zhì)越優(yōu)，且以松貝質(zhì)量為佳，青貝次之，導致歷年來中藥材交易市場上同等級松貝和青貝的價格相差較大。然而松貝的藥效指標是否一定高于青貝？該問題引起了越來越多中藥研究人員的重視和關注。在此背景下，本研究以同等級的松貝、青貝為研究對象，利用整體動物實驗法來驗證松貝和青貝的醇提物、水提物以及粉末的鎮(zhèn)咳、平喘、化痰及抗炎作用差異，為下一步的臨床試驗及深入研究川貝藥材商品規(guī)格等級劃分及合理定價問題提供參考。

1 材料

1.1 儀器

YLS-8A多功能誘咳引喘儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；FA1004電子天平（上海恒平科學儀器有限公司）；AUW220D分析天平、2201紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

松貝、青貝均為一等品（規(guī)格：均為每粒約0.17 g），購自成都市荷花池中藥材專業(yè)市場，經(jīng)西南醫(yī)科大學中藥資源與鑒定教研室稅丕先教授鑒定為真品；氫溴酸右美莎芬片（廣州白云山光華制藥股份有限公司，批號：20150602，規(guī)格：15 mg/片，陽性對照藥）；氨茶堿片（國藥集團汕頭金石制藥有限公司，批號：151001，規(guī)格：0.1 g/片，陽性對照藥）；鹽酸氨溴索片（上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，批號：884291，規(guī)格：30 mg/片，陽性對照藥）；醋酸地塞米松片（廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號：150104，規(guī)格：0.75 mg/片，陽性對照藥）；氨水（成都市科龍化工試劑廠，批號：2014091001）；磷酸組胺（上海伯奧生物科技有限公司，批號：071025）；酚紅（成都市科龍化工試劑廠，批號：131210）；二甲苯（成都市科龍化工試劑廠，批號：20130821）。

1.3 動物

健康SPF級KM小鼠234只（體質(zhì)量18～22 g，♀♂各半）和健康普通級豚鼠112只（體質(zhì)量380～400 g，♀♂各半）均由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-17，使用許可證號：SYXK（川）2013-065。動物購入后常規(guī)飼養(yǎng)于室溫為（20±2）℃、濕度為50%～60%的動物房內(nèi)，飼養(yǎng)期間自由攝食和飲水。

2 方法

2.1 藥物制備

（1）醇提物制備：分別取松貝、青貝藥材各25 g，于45℃干燥24 h后稱質(zhì)量，粉碎成粗粉，以10倍量70%乙醇浸漬48 h后進行滲漉提取，收集初漉液，保存；繼續(xù)滲漉提取2次，回收乙醇，濃縮干燥，稱取醇提物，收率為8.4%。（2）水提物制備：分別取松貝、青貝藥材各25 g，于45℃干燥24 h后稱質(zhì)量，粉碎成粗粉，以10倍量蒸餾水煎煮3次，每次1 h，合并3次煎液，濃縮干燥，稱取水提物，收率為10.6%。（3）粉末制備：分別取松貝、青貝藥材各25 g，于45℃干燥24 h后稱質(zhì)量，全部粉碎成可通過300目篩的微粉，稱取藥材微粉，收率為90.3%。（4）陽性對照藥：分別取相應陽性對照藥研磨成極細粉，備用。以上藥物均用蒸餾水制備成相應濃度的藥液，給藥體積均為0.15 mL/10 g。

2.2 動物分組與劑量設計

2.2.1 分組 根據(jù)需要進行初篩[4-5]，將合格的小鼠或者豚鼠按體質(zhì)量和性別隨機分為空白對照組（蒸餾水），松貝和青貝的醇提物組、水提物組、粉末組以及陽性對照組，每組10只。

2.2.2 給藥劑量設計 參考文獻[6]中計算方法并加以改進。2015年版《中國藥典》（一部）中川貝用藥劑量為3～10 g，成人體質(zhì)量按60 kg算，小鼠與人的等效劑量換算系數(shù)為12.3，豚鼠與人的等效劑量換算系數(shù)為4.6，最終以各組數(shù)據(jù)的幾何平均數(shù)為各組小鼠、豚鼠的青貝和松貝的給藥劑量（小鼠為1.13 g/kg、豚鼠為0.42 g/kg，均以生藥量計）；陽性對照藥物給藥劑量按同樣方法計算；空白對照組動物給予相同劑量的蒸餾水。

2.3 止咳實驗

參照文獻[7-8]方法略加改進。取小鼠按“2.2.1”項下方法分組，按“2.2.2”項下劑量灌胃相應藥物，其中陽性對照組小鼠灌胃氫溴酸右美莎芬0.013 g/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d，給藥期間小鼠自由進食、飲水。末次給藥后30 min，將小鼠放入加有濃氨水（25%）的多功能誘咳引喘儀內(nèi)，霧化吸入15 s。觀察并記錄各組小鼠的咳嗽潛伏期（從噴霧開始到小鼠出現(xiàn)咳嗽的時間）和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)（以小鼠腹肌收縮、張口呼吸或發(fā)出咳嗽聲為判斷標準）。

2.4 平喘實驗

參考文獻[9]方法。取豚鼠按“2.2.1”項下方法分組，按“2.2.2”項下劑量灌胃相應藥物，其中陽性對照組豚鼠灌胃氨茶堿0.033 g/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d，給藥期間豚鼠自由進食、飲水。末次給藥后30 min，定量噴霧2%磷酸組胺引喘15 s，觀察記錄各組豚鼠的引喘潛伏期[自噴霧開始到哮喘發(fā)作（呼吸困難、抽搐甚至跌倒）的時間]和抽搐跌倒只數(shù)，超過6 min仍未出現(xiàn)癥狀者，引喘潛伏期以6 min計。

2.5 化痰實驗

參考文獻[5，10-11]方法。取小鼠按“2.2.1”項下方法分組，按“2.2.2”項下劑量灌胃相應藥物，其中陽性對照組小鼠灌胃鹽酸氨溴索21.304 g/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d，給藥期間小鼠自由進食、飲水。末次給藥后30 min，各組小鼠均按0.1 mL/10 g腹腔注射5%酚紅溶液，30 min后將小鼠脫頸處死，分離氣管。取甲狀軟骨下至氣管分支處氣管，放入裝有2 mL生理鹽水的試管中，加入0.1 mL氫氧化鈉（1 mol/L），用分光光度計（波長為546 nm）測定光密度（OD）值，通過標準曲線計算酚紅含量。

2.6 抗炎實驗

參考文獻[12]方法。取小鼠按“2.2.1”項下方法分組，按“2.2.2”項下劑量灌胃相應藥物，其中陽性對照組小鼠灌胃醋酸地塞米松9.225×10－4g/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d，給藥期間小鼠自由進食、飲水。末次給藥后30 min，用微量移液管將50 μL二甲苯均勻涂抹在小鼠右耳同一位置的內(nèi)外兩側(cè)（各25 μL）。致炎30 min后處死小鼠，沿耳廓基線剪掉雙耳，用直徑9 mm的耳腫打孔器在雙耳同一部位打下圓片，分析天平精密稱質(zhì)量，計算耳腫脹度[耳腫脹度（mg）＝右耳片質(zhì)量（mg）－左耳片質(zhì)量（mg）]和耳腫脹抑制率[耳腫脹抑制率（%）＝空白對照組平均耳腫脹度－給藥組平均耳腫脹度/空白對照組平均耳腫脹度×100%]。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，正態(tài)分布的連續(xù)變量的組間比較采用LSD檢驗，非正態(tài)分布的組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 止咳實驗結(jié)果

與空白對照組比較，陽性對照組以及松貝和青貝的醇提物組、粉末組小鼠的咳嗽潛伏期均顯著延長，3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），松貝和青貝的水提物組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與松貝相同組間比較，青貝醇提物組小鼠咳嗽潛伏期顯著延長（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠的咳嗽潛伏期和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of coughing latent period and coughing times within 3 min of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠的咳嗽潛伏期和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of coughing latent period and coughing times within 3 min of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與松貝相同組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.corresponding group of F.cirrhosa，#P＜0.05

3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)33.24±9.23 20.53±8.11＊27.61±9.62 17.59±8.48＊＊17.92±8.35＊＊28.12±8.06 16.71±8.39＊＊12.76±6.94＊＊組別空白對照組松貝醇提物組松貝水提物組松貝粉末組青貝醇提物組青貝水提物組青貝粉末組陽性對照組（氫溴酸右美莎芬）咳嗽潛伏期，s 25.85±6.72 48.76±18.89＊＊31.83±10.97 59.95±20.25＊＊58.52±20.36＊＊#30.56±10.71 61.38±21.29＊＊68.33±21.47＊＊

3.2 平喘實驗結(jié)果

給藥前，各組豚鼠的引喘潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥后，與空白對照組比較，陽性對照組、松貝和青貝的醇提物組、粉末組豚鼠的引喘潛伏期顯著延長（P＜0.05或P＜0.01）；陽性對照組、松貝粉末組和青貝的醇提物、粉末組豚鼠的抽搐跌倒只數(shù)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）；松貝和青貝的水提物組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與松貝相同組間比較，青貝各組豚鼠的引喘潛伏期和抽搐跌倒只數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組豚鼠的引喘潛伏期和抽搐跌倒只數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of cough induction latent period and the number of guinea pig with convulsive fall in each group（±s，n＝10）

表2 各組豚鼠的引喘潛伏期和抽搐跌倒只數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of cough induction latent period and the number of guinea pig with convulsive fall in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組松貝醇提物組松貝水提物組松貝粉末組青貝醇提物組青貝水提物組青貝粉末組陽性對照組（氨茶堿）引喘潛伏期，s給藥前55.90±8.36 55.96±9.32 55.39±7.88 55.61±8.74 54.90±9.03 54.84±8.75 55.45±7.96 54.68±9.12給藥后56.23±7.88 71.16±10.39＊63.25±11.73 118.91±14.58＊＊71.26±11.58＊61.86±12.33 119.88±15.13＊＊128.78±16.26＊＊抽搐跌倒數(shù)，只10 8 9 5＊＊7＊9 5＊＊3＊＊

3.3 化痰實驗結(jié)果

與空白對照組比較，各給藥組小鼠氣管中酚紅含量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；與松貝相同組比較，青貝粉末組小鼠氣管中酚紅含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠的氣管酚紅含量測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Determination of phenol red content in the trachea of mice in each group（±s，n＝10）

表3 各組小鼠的氣管酚紅含量測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Determination of phenol red content in the trachea of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與松貝相同組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.corresponding group of F.cirrhosa，#P＜0.05

組別空白對照組松貝醇提物組松貝水提物組松貝粉末組青貝醇提物組青貝水提物組青貝粉末組陽性對照組（鹽酸氨溴索）氣管中酚紅含量，μg/mL 1.56±0.44 2.15±0.61＊2.42±0.52＊＊2.52±0.58＊＊2.19±0.56＊2.51±0.49＊＊2.60±0.54＊＊2.68±0.57＊＊

3.4 抗炎實驗結(jié)果

與空白對照組比較，各給藥組小鼠的耳腫脹程度均顯著減小、耳腫脹抑制率均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；與松貝相同組比較，青貝各組小鼠的耳腫脹度差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠的耳腫脹度和耳腫脹抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Determination of ear swelling degree and inhibitory rate of ear swelling of mice in each group（±s，n＝10）

表4 各組小鼠的耳腫脹度和耳腫脹抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Determination of ear swelling degree and inhibitory rate of ear swelling of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組松貝醇提物組松貝水提物組松貝粉末組青貝醇提物組青貝水提物組青貝粉末組陽性對照組（醋酸地塞米松）耳腫脹抑制率，%0 34.20＊40.93＊44.25＊34.12＊41.41＊44.25＊50.25＊＊耳腫脹度，mg 12.34±4.38 8.12±3.61＊7.29±2.63＊6.88±1.57＊8.13±3.56＊7.23±2.48＊6.88±1.52＊6.14±1.55＊

4 討論

松貝、青貝主要來源于川貝母、暗紫貝母和甘肅貝母等基源植物，分布較廣，不同環(huán)境條件、生長周期、栽培方法會導致種間、種內(nèi)變異復雜，鱗莖大小、形態(tài)很難區(qū)分，以野生為主的松貝、青貝?；煸谝黄鸩赏诔鍪踇13]，導致品種很難鑒別，產(chǎn)地也無法考證，除非采用近紅外光譜技術(shù)[14]、DNA分子生物學[15]等現(xiàn)代科學技術(shù)進行品種分類，這在川貝交易中不易實現(xiàn)，因此給后續(xù)質(zhì)量控制、生產(chǎn)流通及臨床應用等增加了不確定性與難度。

中藥材常以商品規(guī)格等級來鑒別其品種真?zhèn)渭百|(zhì)量優(yōu)劣，商品規(guī)格是中藥材品質(zhì)的外在表現(xiàn)和標志，是市場流通的表現(xiàn)形式，也是交易定價的依據(jù)。從理論上看，藥材商品規(guī)格等級與其有效成分含量、價格與藥效之間應具必然聯(lián)系，然而事實并非如此。本研究發(fā)現(xiàn)，同等級（一等品）的松貝價格比青貝高500元/kg，而青貝的止咳、平喘、化痰、抗炎效果略優(yōu)于松貝或與之相當?？梢姡ㄘ愃幉牡纳唐芬?guī)格（松貝、青貝）、市場價格、藥效與傳統(tǒng)認知存在不一致的情況。由于川貝顆粒大小不同，其有效成分有明顯差異[16]，故本研究選用顆粒大小相近的松貝和青貝進行實驗。因為川貝傳統(tǒng)用藥方法是粉末和水煎劑[17]，而成方制劑的提取方式多采用乙醇滲漉法，所以本研究對松貝和青貝的水提物、醇提物和粉末3種給藥形式的研究具有一定的依據(jù)。本研究還發(fā)現(xiàn)，松貝和青貝以全粉入藥效果最好，其止咳效果較好；水提物的化痰效果較好，粉末形式的平喘效果較好。因此，筆者建議無論是單味入藥還是復方入藥，少量用藥還是大量成方投料，盡量采用松貝、青貝的粉末形式入藥，除非特殊工藝條件要求所需，則根據(jù)所需功效選擇不同提取物入藥。

陳泓竹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，青貝止咳效果優(yōu)于松貝，抗炎效果稍次于松貝；楊慶等[18]研究發(fā)現(xiàn)，松貝配伍附子在小劑量時鎮(zhèn)痛、抗炎效果遠低于青貝配伍，劑量增加1倍時，效果略優(yōu)于青貝配伍；黃雅彬等[19]研究發(fā)現(xiàn)，松貝止咳效果優(yōu)于青貝，抗炎效果次于青貝。但在上述研究中均未明確藥材等級，只設計了川貝主要作用中的止咳、抗炎實驗。川貝中主要有效成分為生物堿和水溶性非生物堿（如皂苷、核苷、多糖等），不同處理方式會導致不同化學成分含量不一。針對松貝市場價格高于青貝，但其某些化學成分含量低于青貝的問題[20]，筆者引入現(xiàn)代中藥整體藥效學指標來評價傳統(tǒng)經(jīng)驗的正確性。川貝的現(xiàn)行商品規(guī)格等級劃分標準是否科學還有待商榷，目前主要是以經(jīng)驗感知為依據(jù)，且化學成分與藥材商品規(guī)格存在負相關性[22]，缺乏系統(tǒng)性整理和現(xiàn)代科技的支持。故筆者建議將中藥藥效學、粒徑大小、產(chǎn)量、藥源等指標進行客觀綜合化和精準化評價，正確導向市場交易行為，這對我國中藥材商品規(guī)格等級標準的研究具有重要意義。

[1]劉薇，張文娟，程顯隆，等.中藥川貝母質(zhì)量控制方法研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（2）：41-46.

[2]吳小婷.川貝母的真?zhèn)舞b別[J].海峽藥學，2014，26（6）：39-41.

[3]段金廒，肖小河，宿樹蘭，等.中藥材商品規(guī)格形成模式的探討：以當歸為例[J].中國現(xiàn)代中藥，2009，11（6）：14-17.

[4]楊利娟，王張，孟憲麗，等.基于濃氨水引咳法建立小鼠咳嗽敏感性剔除標準的方法學研究[J].中藥藥理與臨床，2010，26（5）：150-151.

[5]杜瑩潔，陳會叢，鐘雨秋，等.同仁堂兒童清肺丸鎮(zhèn)咳祛痰平喘作用的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（6）：2773-2775.

[6]楊仕軍，祖承哲，趙欣，等.不同品種川貝母對小鼠復發(fā)性哮喘的療效比較[J].中草藥，2013，44（15）：2124-2129.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：56-62.

[8]俞琦，歐江琴，馮果，等.固本舒喘顆粒平喘、止咳、祛痰作用的實驗研究[J].貴陽中醫(yī)學院學報，2017，39（2）：16-18、36.

[9]鄒戩，王薇，李杰.山橘葉鎮(zhèn)咳祛痰平喘作用的實驗研究[J].中國藥師，2017，20（2）：256-258.

[10]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：613.

[11]FU SJ，HUANG XZ ，WU LL，et al.Experimental study on the antitussive，apophlegmatic and anti-asthmatic effect of extract of Jianhua[J].Med Plant，2014，5（2）：31-33、38.

[12]陳泓竹，張世洋，黃雅彬，等.平貝母和川貝母總生物堿含量及其鎮(zhèn)咳、抗炎作用比較研究[J].食品工業(yè)科技，2017，38（15）：63-67.

[13]王麗芝.藥材川貝母的品質(zhì)研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2013.

[14]黃潔，單敏，王苑桃，等.近紅外光譜技術(shù)在藥品質(zhì)量控制中的應用與研究進展[J].中國藥房，2017，28（33）：4744-4748.

[15]王曙，劉震東，王聰，等.瓦布貝母品質(zhì)研究[C]//中藥飲片質(zhì)量分析與中藥鑒別技術(shù)交流研討會論文集.北京：北京晟勛炎國際會務服務中心，2009：162-165.

[16]戴暉，吳梓春.不同規(guī)格川貝母中總生物堿的含量測定方法[J].北方藥學，2015，12（8）：18-19.

[17]黃林芳，段寶忠，王麗芝，等.川貝母新資源太白貝母中水溶性成分的含量測定[J].中國中藥雜志，2011，36（5）：585-588.

[18]楊慶，聶淑琴，翁小剛，等.生附片與不同品種貝母配伍的藥效學比較研究[J].中國實驗方劑學雜志，2006，12（6）：25-29.

[19]黃雅彬，劉紅梅，方成鑫，等.不同品種川貝母生物堿鎮(zhèn)咳、抗炎作用比較[J].中藥新藥與臨床藥理，2018，29（1）：19-22.

[20]游靜，張德全，潘興嬌，等.高效液相色譜法同時測定太白貝母與暗紫貝母中9種核苷類成分的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（1）：174-179.

[21]張學儒.大黃藥材商品規(guī)格評價與合理用藥的研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2010.