胡 丹（宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽宿州 234000）

復(fù)方黃芩片由黃芩、虎杖、穿心蓮和十大功勞4味中藥材組成，具有清熱解毒、涼血消腫之功效，用于咽喉腫痛、口舌生瘡、感冒發(fā)熱、癰腫瘡瘍[1]。黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分，有清熱燥濕、瀉火解毒的功效；虎杖中含有虎杖苷，有抗菌消炎、利濕退黃、清熱解毒、止咳化痰的功效；穿心蓮中含有穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯，具有清熱解毒、涼血消腫的功效[2]。已有針對虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測定的文獻(xiàn)報道[2-8]，但是涉及到多種成分同時測定時需要對照品數(shù)量多，但某些對照品提純難度大，使用成本較高。一測多評法（QAMS）的廣泛應(yīng)用，實現(xiàn)了以樣品中某一廉價易得的對照品為內(nèi)參對多種有效成分質(zhì)量的同步控制的要求，該方法在中成藥及中藥飲片質(zhì)量控制中得到了較廣泛的應(yīng)用[9-13]，但采用QAMS法測定復(fù)方黃芩片的有效成分的含量尚未見報道。本研究建立了高效液相色譜（HPLC）-QAMS法同時測定復(fù)方黃芩片中6種活性成分的含量，以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，計算虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯與其之間的相對校正因子（RCF），利用RCF測定各組分含量，并將結(jié)果與外標(biāo)法（ESM）測得數(shù)據(jù)進行比較分析。

1 材料

1.1 儀器

e2695 Waters HPLC儀，包括2695 Alliance四元梯度泵、2695 Alliance自動進樣器、Empower3色譜工作站、2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；1260 Infinity HPLC儀，包括G1311C四元梯度泵、G1329B自動進樣器、Agilent EZchrom色譜工作站、G4212B二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；3000 Ultimate HPLC儀，包括HPG-3x00A二元泵、Split-Loop自動進樣器、Chromeleon 7色譜工作站、PDA-3000二極管陣列檢測器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Quintix 224萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；D115烘箱（德國Binder公司）；SP3-100AL超聲波清洗機（上海泗裴電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方黃芩片（肇慶星湖制藥有限公司，批號：1702062、1703078、1708045、1708067、1709023，規(guī)格：每片0.33 g）；黃芩苷對照品（批號：110715-201619，純度：93.5%）、虎杖苷對照品（批號：111575-201603，純度：87.3%）、漢黃芩苷對照品（批號：112002-201501，純度：98.8%）、黃芩素對照品（批號：111595-201306，純度：97.8%）、穿心蓮內(nèi)酯對照品（批號：110797-201108，純度：98.7%）、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品（批號：110854-201508，純度：99.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 QAMS法概念與原理

QAMS法是通過中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過測定中藥中某個代表性成分（易得、廉價、有效）的含量，依據(jù)RCF計算出該中藥中其他多種待測成分（對照品難以得到或難供應(yīng)）的含量，使其計算值與實測值符合定量方法學(xué)要求的一種多指標(biāo)質(zhì)量同步控制方法[14]。在一定線性范圍內(nèi)某成分的量（質(zhì)量或濃度）與檢測器響應(yīng)值成正比，即f＝A/C（f為校正因子，A表示響應(yīng)值，C表示濃度）。QAMS是以藥材中某一典型組分s（一般該組分對照品易得、廉價）為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物s與其他待測組分k之間的RCF（fk/s），即fk/s＝fk/fs＝（Ak×Cs）/（Ck×As），再通過校正因子計算其他組分的含量Ck＝（Cs×Ak）/（As×fk/s）[15]。

2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，5%→15%A；12～25 min，15%→30%A；25～40 min，30%→45%A；40～50 min，45%→55%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：306 nm（0～7 min虎杖苷）、275 nm（7～15 min黃芩苷）、225 nm（15～23 min穿心蓮內(nèi)酯）、275 nm（23～37 min漢黃芩苷、黃芩素）、254 nm（37～50 min脫水穿心蓮內(nèi)酯）；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 精密稱取虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品各適量，置于同一100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 mL含虎杖苷182.2 μg、黃芩苷1 881.2 μg、漢黃芩苷509.2 μg、黃芩素 515.2 μg、穿心蓮內(nèi)酯 105.3 μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯140.3 μg的混合對照品溶液，室溫避光保存，備用。

2.3.2 供試品溶液 取復(fù)方黃芩片20片，去除糖衣，研細(xì)，得復(fù)方黃芩片細(xì)粉。取復(fù)方黃芩片細(xì)粉約1 g，精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加入30 mL 50%甲醇溶液，室溫超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min后取出，放冷，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得，室溫避光保存。

2.3.3 陰性樣品溶液 按照復(fù)方黃芩片處方工藝分別制備不含虎杖、黃芩和穿心蓮的陰性樣品，按供試品溶液制備和測定方法進行處理，即得。

2.3.4 空白溶劑 取適量甲醇作為空白溶劑。

2.4 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗

在“2.2”項色譜條件下，精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL進樣，結(jié)果各組分與前后峰分離度均大于1.8，對稱因子在1.12～1.45之間，理論板數(shù)以虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計均＞5 000。陰性樣品溶液色譜圖中在與樣品中虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯保留時間相應(yīng)位置上未見色譜峰，說明其他藥味對測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于同一20 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯在試驗范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，見表1。

2.6 檢測限與定量限考察

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of linear range investigation（n＝6）

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積，當(dāng)信噪比為3∶1時即為檢測限；當(dāng)信噪比為10∶1時即為定量限。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測限分別為2.25、6.92、1.76、4.69、1.37、1.51 ng，定量限分別為 6.89、19.98、5.28、13.81、4.15、4.71 ng。

2.7 精密度試驗

精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.53%、1.02%、1.18%、0.85%、0.76%、0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（批號：1702062），分別于制備后0、3、6、9、12、24、48 h按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.35%、0.56%、0.52%、0.62%、0.92%、0.43%、0.89%（n＝7），表明供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批供試品（批號：1702062），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算6種成分的含量及其RSD值。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均含量分別為2.14、22.56、5.85、6.05、1.36、1.65 mg/g，RSD分別為0.59%、0.41%、0.89%、1.02%、0.85%、1.12%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的復(fù)方黃芩片（批號：1702062）細(xì)粉，共9份，每份約0.5 g，分成3組，精密稱定后分別置于50 mL棕色量瓶中，分別加入“2.3.1”項下混合對照品溶液4、6、8 mL，按“2.3.2”項下供試品溶液方法制備，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算各成分加樣回收率及其RSD值。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為98.2%、98.8%、97.9%、98.9%、98.8%、98.7%，RSD分別為1.32%、1.14%、1.23%、1.00%、0.91%、1.12%（n＝9）。

2.11 RCF的計算

在標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝ax+b中，x＝（y－b）/a＝y(tǒng)/a－b/a，由于b值通常為誤差引起，在a/b值大于100時，b/a值可以忽略不計，此時可以公式x＝y(tǒng)/a直接計算其含量。故RCF可以二者的斜率a的比直接計算，計算公式為fk/s＝ak/as，式中as為內(nèi)參物標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；ak為其他待測組分標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。根據(jù)表1中回歸方程，以275 nm波長下黃芩苷為內(nèi)參物（1.000），306 nm波長下的虎杖苷RCF為0.529；275 nm波長下的漢黃芩苷、黃芩素的RCF分別為0.506、1.004；225 nm波長下的穿心蓮內(nèi)酯RCF為0.831；254 nm波長下的脫水穿心蓮內(nèi)酯RCF為1.087。

2.12 RCF重現(xiàn)性考察

考察流動相各梯度點組分比例變化、流速變化、柱溫變化以及各成分檢測波長變化時對RCF的影響。結(jié)果，流動相各梯度點比例變化±5%，流速變化±10%，柱溫變化±5℃，各活性成分檢測波長變化±2 nm時對各成分的RCF影響較小，RSD均在3.0%以內(nèi)。另外，本研究還考察了不同品牌HPLC儀及3種不同品牌色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18、Inertsil ODS-SPHPLC Column、Waters Sunfire C18（規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）對RCF的影響，結(jié)果不同HPLC儀、不同色譜柱條件下虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯RCF的RSD依次為1.3%、1.4%、1.0%、0.9%、1.4%，RSD均小于2.0%。不同HPLC儀器及色譜柱對RCF的影響見表2。

表2 不同HPLC儀器及色譜柱對RCF的影響（n＝3）Tab 2 Effects of different HPLC instrument and chromatographic column on RCF（n＝3）

2.13 待測色譜峰的定位

色譜峰的準(zhǔn)確定位是QASM法應(yīng)用的關(guān)鍵，可采用保留時間差（指各待測成分與內(nèi)參物間保留時間的差值）或相對保留時間（指各待測成分與內(nèi)參物間保留時間的比值）等參數(shù)，并結(jié)合色譜圖整體特征，以及每個峰的紫外吸收特征來定位待測成分色譜峰[15]。本研究通過考察保留時間差和相對保留時間兩種參數(shù)在不同品牌HPLC儀和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果，保留時間差的波動較為明顯（RSD＞5%），相對保留時間的波動相對較小（RSD＜3.5%）。因此，采用相對保留時間法進行待測成分色譜峰的定位。但是對于成分復(fù)雜的樣品，可選用定性用的對照品或“對照提取物”對待測成分進行定位，此法峰定位準(zhǔn)確，受色譜條件及內(nèi)參物變化干擾小[16]。

2.14QASM與ESM結(jié)果比較

按“2.2”項下色譜條件，分別精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣測定，記錄虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，分別采用ESM和QASM對5批復(fù)方黃芩片中6種活性成分含量進行測定，并利用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0對兩組含量結(jié)果進行成組t檢驗，驗證QASM方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果，兩種方法測得6種活性成分含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同方法測定復(fù)方黃芩片中6種成分含量的結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Determination results of 6 components in Compound huangqin tablets by different methods（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的選擇 在選擇流動相時，筆者分別考察了甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液及乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液。結(jié)果，甲醇-0.05%磷酸作為流動相時，穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯未被檢出；而采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液時，黃芩苷和虎杖苷色譜峰分離度未達(dá)到要求；當(dāng)采用乙腈-0.05%磷酸溶液流動相系統(tǒng)時，6種活性成分色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰分離完全，對稱因子在1.12～1.45之間，故以此作為流動相。

3.1.2 檢測波長的選擇 在選擇檢測波長時，筆者在190～400 nm波長段分別掃描6種活性成分混合對照品溶液，結(jié)果虎杖苷在306 nm波長處有最大吸收，黃芩苷在278 nm波長處有最大吸收，漢黃芩苷在275 nm波長處有最大吸收，黃芩素在274 nm波長處有最大吸收，穿心蓮內(nèi)酯在225 nm波長處有最大吸收，脫水穿心蓮內(nèi)酯在254 nm波長處有最大吸收。參考文獻(xiàn)[2-8]，最終確定虎杖苷檢測波長為306 nm，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素檢測波長為275 nm，穿心蓮內(nèi)酯檢測波長為225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長為254 nm。本試驗采用波長切換法，在不同時段改變檢測波長，保證了6種活性成分均在最佳吸收波長處檢測。

3.2 檢測方法的選擇

文獻(xiàn)[2-3]在測定復(fù)方黃芩片中有效成分含量時，采用獨立對照品用ESM測定其含量，經(jīng)方法學(xué)驗證，均得到可靠結(jié)果。另HPLC定量方法中一般以回歸方程法計算結(jié)果最為準(zhǔn)確，但當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線a/b值大于100時，可采用外標(biāo)法一點法計算，ESM也是應(yīng)用最為普遍的定量方法[17]。故本研究選擇ESM測得數(shù)據(jù)結(jié)果進行比對來驗證QASM的準(zhǔn)確性。黃芩苷為黃芩藥材中的主要成分之一，也是黃芩的特征性成分代表，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，容易取得，故選其作為內(nèi)參物，對虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯進行定量。

4 結(jié)論

本研究建立的QASM法可同時測定復(fù)方黃芩片中6種活性成分含量，以黃芩苷為內(nèi)參物，分別計算虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯與內(nèi)參物之間的RCF，并通過不同儀器、不同色譜柱、改變柱溫、改變檢測波長及調(diào)整流動相比例等因素考察QASM法的耐用性，結(jié)果改變上述條件對各成分RCF影響均很小。通過比較ESM法和QASM法對5批復(fù)方黃芩片含量測定的結(jié)果，得出兩種方法測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），驗證了QASM法用于復(fù)方黃芩片中6種活性成分質(zhì)量評價的準(zhǔn)確性。

綜上，本研究建立的方法簡單、有效、結(jié)果準(zhǔn)確、節(jié)約成本，可用于復(fù)方黃芩片中上述6種活性成分含量的同時測定。

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