金粟，王秀麗，曲昌海，阮婧華（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京0002；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550002）

脂化乳與生物膜具有良好的生物相容性，將難溶性藥物制備成脂化乳劑后，可以增加藥物的溶解度，提升藥物的胃腸道穩(wěn)定性，降低刺激性，也可以促進(jìn)藥物的腸淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，提高生物利用度[1-2]，因此具有良好的應(yīng)用前景。通過(guò)提升脂化乳的穩(wěn)定性，對(duì)于擴(kuò)展其應(yīng)用范圍具有很大幫助。

甘草次酸的油水分配系數(shù)P的對(duì)數(shù)值lgP為6.57，其難溶于水，水中溶解度僅為6.32 mg/L[3]，口服生物利用度低，適合包載于脂化乳，因此本文選擇以甘草次酸為模型藥，選擇以非離子型聚丙烯酰胺（型號(hào)：NPAM 1400）為穩(wěn)定輔料，加入到甘草次酸脂化乳中，考察其對(duì)脂化乳穩(wěn)定性的提升效果，并以此濃度與前期[4]篩選的兩種納米微粉硅膠（nSiO2）進(jìn)行組合，考察兩種材料組合使用對(duì)甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性的影響，初步確定兩種穩(wěn)定輔料的加入濃度，以期對(duì)進(jìn)一步提升脂化乳的體外穩(wěn)定性提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

G16型醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；BS110S型萬(wàn)分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SCI-ENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘草次酸脂化乳（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：201604，規(guī)格：約含甘草次酸1.25 mg/mL）；非離子型聚丙烯酰胺（上海麥克林生化技術(shù)有限公司，型號(hào)：NPAM 1400，批號(hào)：P821242）；nSiO2（廣州市敬益新材料有限公司，型號(hào)：親水性-380、疏水性-215）；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 穩(wěn)定輔料的選擇

2.1.1 非離子型聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺是丙烯酰胺均聚物或與其他單體共聚而成的線性高分子化合物的總稱，是水溶性高分子化合物中應(yīng)用最為廣泛的品種之一。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)中具有酰胺鍵，易形成氫鍵，具有良好的水溶性，可以被用作有效的絮凝劑、增稠劑等。已有研究[5-6]報(bào)道，聚丙烯酰胺為無(wú)細(xì)胞毒性材料，并且對(duì)長(zhǎng)期使用其的患者進(jìn)行血常規(guī)和尿常規(guī)檢查均顯示無(wú)異常。故本文選擇以非離子型聚丙烯酰胺為穩(wěn)定輔料，將一定濃度的非離子型聚丙烯酰胺加入到甘草次酸脂化乳中，希望通過(guò)增加制劑的黏度，提升脂化乳的物理穩(wěn)定性。

2.1.2 nSiO2nSiO2是一種具有良好生物相容性、物理化學(xué)穩(wěn)定性的超微納米材料，可以對(duì)脂化乳制劑穩(wěn)定性提升起到一定的作用[4]。因此，本文選擇親水性和疏水性的nSiO2分別與非離子型聚丙烯酰胺組合使用，希望能進(jìn)一步提高甘草次酸脂化乳的穩(wěn)定性。

2.2 穩(wěn)定性考察

2.2.1 穩(wěn)定性系數(shù) 本文采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，分別測(cè)定脂化乳離心前后稀釋液在一定波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算穩(wěn)定性系數(shù)（KE）[7]，KE值越小，說(shuō)明離心操作對(duì)制劑中分散顆粒上浮或下沉的影響越小，即制劑穩(wěn)定性越高，以此來(lái)評(píng)判加入穩(wěn)定輔料后甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性的提升效果。具體操作：取制劑1 mL于1.5 mL尖底離心管中，以離心半徑為5.7 cm、4 000 r/min離心10min，精密移取下層制劑（取樣深度1 cm處）至10 mL量瓶中，純凈水定容，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)以純凈水調(diào)零，檢測(cè)500 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）；另精密移取未離心的制劑1 mL于10 mL量瓶中，純凈水定容，同法檢測(cè)500 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A0），按公式KE＝（A0－A）/A0×100%計(jì)算KE。

2.2.2 穩(wěn)定性系數(shù)之比 為了減小誤差，消除每批空白制劑之間的差別，筆者還以穩(wěn)定性系數(shù)之比（KE/KE空白）作為評(píng)價(jià)加入不同穩(wěn)定輔料后甘草次酸脂化乳穩(wěn)定效果的指標(biāo)，公式為KE/KE空白＝加入穩(wěn)定輔料后制劑的KE/未加入穩(wěn)定輔料的制劑的KE空白。

2.3 非離子型聚丙烯酰胺單用

2.3.1 非離子型聚丙烯酰胺濃度初篩 非離子型聚丙烯酰胺為水溶性高分子材料，本研究將非離子型聚丙烯酰胺隔夜充分溶脹作為水相，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，與甘草次酸脂化乳劑混合制備得到含非離子型聚丙烯酰胺0、200、400、600 mg/L的甘草次酸脂化乳[8]。根據(jù)加入非離子型聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度不同，分為空白脂化乳組和非離子型聚丙烯酰胺200、400、600 mg/L脂化乳組，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法計(jì)算KE，比較各組制劑的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 200、400、600 mg/L非離子型聚丙烯酰胺對(duì)甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性的影響（n＝3）Tab 1 Effects of 200，400，600 mg/L non-ionic polyacrylamide on the stability of Glycyrrhetinic acid lipo-emulsion（n＝3）

由表1結(jié)果可以看出，空白脂化乳組的KE為17.20%，加入非離子型聚丙烯酰胺后，除非離子型聚丙烯酰胺200 mg/L脂化乳組的KE大于空白脂化乳組外，其余兩組脂化乳的KE均減小，表明加入400、600 mg/L非離子型聚丙烯酰胺可提高甘草次酸脂化乳的穩(wěn)定性，其中400 mg/L時(shí)對(duì)穩(wěn)定性的提升效果較明顯。

2.3.2 非離子型聚丙烯酰胺濃度的確定 在“2.3.1”項(xiàng)下結(jié)果的基礎(chǔ)上，再次制備含非離子型聚丙烯酰胺0、300、400、500 mg/L的甘草次酸脂化乳，根據(jù)加入非離子型聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度不同，分為空白脂化乳組和非離子型聚丙烯酰胺300、400、500 mg/L脂化乳組，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法計(jì)算KE，比較各組制劑的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 300、400、500 mg/L非離子型聚丙烯酰胺對(duì)甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性的影響（n＝3）Tab 2 Effects of 300，400，500 mg/L non-ionic polyacrylamide on the stability of Glycyrrhetinic acid lipo-emulsion（n＝3）

由表2結(jié)果可以看出，加入非離子型聚丙烯酰胺的甘草次酸脂化乳的KE均小于空白脂化乳組，說(shuō)明加入非離子型聚丙烯酰胺可以有效提升甘草次酸脂化乳的離心穩(wěn)定性。通過(guò)比較KE的差異，可以發(fā)現(xiàn)隨著非離子型聚丙烯酰胺加入質(zhì)量濃度的增加，KE表現(xiàn)出先增大后減小的現(xiàn)象，但3個(gè)質(zhì)量濃度之間差別不大。遵循盡量減少應(yīng)用輔料原則，最終確定非離子型聚丙烯酰胺加入質(zhì)量濃度為300 mg/L。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 平行制備3批非離子型聚丙烯酰胺加入質(zhì)量濃度為300 mg/L的甘草次酸脂化乳及不加非離子型聚丙烯酰胺的甘草次酸脂化乳（空白脂化乳），分別按“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算KE和KE/KE空白。結(jié)果顯示，空白脂化乳的KE空白為17.6%，3批含非離子型聚丙烯酰胺300mg/L的甘草次酸脂化乳的KE分別為3.8%、3.9%、3.3%（RSD＝9%，n＝3），KE/KE空白分別為0.22、0.22、0.19，結(jié)果均在可接受范圍內(nèi)，表明該方法基本穩(wěn)定。由此確定，非離子型聚丙烯酰胺可提高甘草次酸脂化乳的離心穩(wěn)定性，其加入質(zhì)量濃度為300 mg/L。

2.4 非離子型聚丙烯酰胺與nSiO2聯(lián)用

根據(jù)“2.3”項(xiàng)下結(jié)果和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，考察300 mg/L非離子型聚丙烯酰胺分別與不同濃度nSiO2[親水性（0.2%、0.3%、0.4%）和疏水性（0.2%、0.3%、0.5%）]聯(lián)用對(duì)甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性的影響。試驗(yàn)分為空白脂化乳組，低、中、高濃度親水性nSiO2脂化乳組，低、中、高濃度疏水性nSiO2脂化乳組，非離子型聚丙烯酰胺+低、中、高濃度親水性nSiO2脂化乳組，非離子型聚丙烯酰胺+低、中、高濃度疏水性nSiO2脂化乳組，分別按“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算KE和KE/KE空白，比較各組制劑的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 300 mg/L非離子型聚丙烯酰胺與nSiO2聯(lián)用對(duì)甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性的影響Tab 3 Effects of 300 mg/L non-ionic polyacrylamide combined with different concentrations nSiO2 on the stability of Glycyrrhetinic acid lipoemulsion

由表3結(jié)果可以看出，在甘草次酸脂化乳只加入nSiO2時(shí)，低濃度疏水性nSiO2脂化乳組的KE最??；非離子型聚丙烯酰胺與nSiO2聯(lián)用時(shí)，非離子型聚丙烯酰胺+低濃度疏水性nSiO2脂化乳組的KE最小。但是結(jié)合“2.3.3”項(xiàng)下結(jié)果，單獨(dú)使用非離子型聚丙烯酰胺的甘草次酸脂化乳的KE/KE空白約為0.22，而非離子型聚丙烯酰胺+0.20%疏水性nSiO2脂化乳的KE/KE空白為0.27，排除空白脂質(zhì)體的干擾后可以看出，非離子型聚丙烯酰胺與疏水性nSiO2聯(lián)用時(shí)甘草次酸脂化乳的穩(wěn)定性并沒(méi)有比單用非離子型聚丙烯酰胺時(shí)提高。綜合考慮，單用300 mg/L非離子型聚丙烯酰胺時(shí)甘草次酸脂化乳的穩(wěn)定性最好。

3 討論

穩(wěn)定體系對(duì)提高脂化乳制劑穩(wěn)定性作用明顯，本課題組已經(jīng)進(jìn)行了大量的穩(wěn)定輔料的考察，篩選出了nSiO2和聚丙烯酰胺的增加穩(wěn)定性效果較為突出[4]。nSiO2是通過(guò)物理包裹的方式提高脂化乳的穩(wěn)定性。聚丙烯酰胺溶于水后可以形成網(wǎng)狀的立體結(jié)構(gòu)，避免了脂化乳粒相互聚集，聚丙烯酰胺黏度隨溫度降低而增大[9]，脂化乳放置在室溫下，溫度降低可以更好地發(fā)揮聚丙烯酰胺提高脂化乳穩(wěn)定性的效果。

筆者在預(yù)試驗(yàn)中對(duì)聚丙烯酰胺的種類也進(jìn)行了篩選，分別考察了非離子型和陰離子型兩種聚丙烯酰胺單獨(dú)使用對(duì)甘草次酸脂化乳離心穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，非離子型聚丙烯酰胺提高脂化乳穩(wěn)定性的效果更好，因此本研究?jī)H對(duì)非離子型聚丙烯酰胺開(kāi)展進(jìn)一步的試驗(yàn)，比較了非離子型聚丙烯酰胺單獨(dú)使用及其與nSiO2聯(lián)合使用時(shí)對(duì)甘草次酸脂化乳離心穩(wěn)定性的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用nSiO2和聚丙烯酰胺兩種穩(wěn)定輔料時(shí)，脂化乳的穩(wěn)定性沒(méi)有明顯的提高，考慮原因可能是nSiO2與聚丙烯酰胺提高穩(wěn)定性的原理不同所致，具體原因有待進(jìn)一步研究。最終結(jié)果顯示，單用300 mg/L非離子型聚丙烯酰胺時(shí)甘草次酸脂化乳的穩(wěn)定性最好。

[1]陳芳寧，張秀榮，王秀麗，等.丹酚酸B脂化乳的制備及其穩(wěn)定性研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2017，32（2）：179-182.

[2]李士遠(yuǎn).抗癌先導(dǎo)物T-OA脂質(zhì)體及甘草次酸脂質(zhì)體的腸淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[3]曹姍.口服甘草次酸急性毒性、體內(nèi)分布及對(duì)血清離子元素含量影響的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2012.

[4]李士遠(yuǎn)，金粟，陳芳寧，等.不同加入量親水性/疏水性納米二氧化硅對(duì)甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性的影響研究[J].中國(guó)藥房，2017，28（7）：951-953.

[5]田菲，吳軍正，魯開(kāi)化，等.聚丙烯酰胺水凝膠對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究[C].長(zhǎng)春：首屆國(guó)際醫(yī)用聚丙烯酰胺水凝膠--奧美定學(xué)術(shù)研討會(huì)，2000：326-329.

[6]VON BUELOW S，VON HEIMBURG D，PALLUA N.Efficacy and safety of polyacrylamide hydrogel for facial softtissue augmentation[J].Plast Reconstr Surg，2005，116（4）：1137-1146.

[7]馬萍，辛艷茹，楊京燕，等.離心分光光度法測(cè)定乳劑的穩(wěn)定性[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2001，19（1）：23.

[8]金粟，李士遠(yuǎn)，張秀榮，等.甘草次酸脂化乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)探討[J].中國(guó)藥房，2017，28（6）：800-803.

[9]孫紅英，陳紅祥，李金波，等.聚丙烯酰胺溶液粘度的影響因素[J].精細(xì)石油化工進(jìn)展，2005，6（9）：1-3.