魯艷柳，黃思，劉浩，曾瑤，王建秋，徐亞沙，陸遠(yuǎn)富，何芋岐（遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563003）

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）為蘭科石斛屬（DendrodiumSW.）植物，是《中國藥典》明確規(guī)定的藥用石斛的植物來源，又名扁金釵、扁黃草、扁草、黃草等[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品，素有“千金草”之稱[2]，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳、明目強(qiáng)身等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金釵石斛總生物堿是金釵石斛的主要活性成分，具有止痛、解熱作用，可以降低心率、血壓，減慢呼吸，并且緩解巴比妥引起的中毒癥狀[3]，還具有降血糖[4]、抗白內(nèi)障[5]、抗腫瘤[6]、減少細(xì)胞凋亡[7]、抗氧化[8]和抗老年癡呆[9]等作用。而石斛堿（Dendrobine）是金釵石斛總生物堿中最主要的特征性成分[1，3]，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。本課題組前期鑒定出石斛堿在人肝微粒體中的主要代謝產(chǎn)物有M-250、M-280[10]，本文在此基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜/一測多評法（UPLC-MS/QAMS），首次建立了測定小鼠血漿中石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280濃度的方法，為進(jìn)一步研究石斛堿的藥動學(xué)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的結(jié)構(gòu)圖見圖1。

圖1 石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structures diagrams of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨MS系統(tǒng)和Thermo Ultrmate 3000 UPLC系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）；Genius 1022液氮發(fā)生器（英國Peak公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；XS205電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；XW-80A漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Microfuge 20R高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter有限公司）。

1.2 藥品與試劑

石斛堿對照品（北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：D990100，純度：≥99.0%）；鹽酸偽麻黃堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：171237-201208，純度：≥99.9%）；乙腈、甲醇、甲酸均為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康SPF級C57BL/6J小鼠24只，♂，體質(zhì)量18～22 g，由重慶第三軍醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（渝）2012-0005，飼養(yǎng)溫度 21～22℃，濕度56%～65%，明暗交替時間12/12 h。本實(shí)驗(yàn)符合遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為空白對照組和給藥組，每組12只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。根據(jù)本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果，給藥組小鼠按60 mg/kg灌胃石斛堿[以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液助懸]，空白對照組小鼠灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液，1 h后，眼眶取血0.2 mL至肝素化的離心管中，1 856×g離心15 min，分離血漿待測。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取石斛堿對照品15.52 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度，混勻，即得對照品貯備液，于4℃保存，備用。使用前以乙腈稀釋，得到含石斛堿質(zhì)量濃度分別為51.73、15.52、7.76、1.55、0.78、0.16μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取鹽酸偽麻黃堿對照品10.01mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度線，混勻，即得內(nèi)標(biāo)貯備液，于4℃保存，備用。使用前以乙腈稀釋，得到含鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度為0.4μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的制備

分別取100μL空白血漿，加入不同質(zhì)量濃度的石斛堿對照品溶液20μL，渦旋30 s，再依次加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL和乙腈200 μL，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液，即得含石斛堿質(zhì)量濃度分別為912.94、456.47、91.29、45.65、9.13、3.04、0.91 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。其中，質(zhì)量濃度為912.94、91.29、9.13 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品為高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，均平行制備5份。

2.4 血漿樣品的處理

取100μL血漿樣品，加入乙腈20μL，渦旋30 s，再依次加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL和乙腈200μL，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液50 μL，進(jìn)樣分析。

2.5 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.5.1色譜條件色譜柱：Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min，5%B；0.5～15 min，5%→95%B；15～17 min，95%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.5.2 MS條件 采用可加熱電噴霧離子源（HESI）的離子化方式；霧化溫度：300℃；離子傳輸管溫度：350℃；鞘氣流速：35 arb；輔助氣流速：15 arb；噴霧電壓：3.5 kV；碰撞電壓：30、40、50 eV；質(zhì)荷比（m/z）檢測范圍：100～1 500；掃描模式：全掃描/正離子模式；全掃描模式下分辨率：70 000 FWHM。

2.6 專屬性考察

取100μL空白血漿，加入200μL乙腈，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液即得空白血漿樣品。取空白血漿樣品、標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品和按“2.4”項(xiàng)下方法處理得到的血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，石斛堿（[M+H]+m/z264.195 9）及其代謝產(chǎn)物M-250（[M+H]+m/z250.180 1）、M-280（[M+H]+m/z280.190 6）的保留時間分別為7.76、7.73、8.11 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的測定。石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的選擇離子圖見圖2。

2.7 線性關(guān)系、定量下限和檢測限考察

取“2.3”項(xiàng)下對應(yīng)樣品進(jìn)樣測定后，采用加權(quán)（1/X2）最小二乘法，以石斛堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），石斛堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y＝－10－5x2+0.043 2x+0.430 9（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，石斛堿檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為9.13～912.94 ng/mL，定量下限為3.04 ng/mL，檢測限為0.91ng/mL。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)考察

取“2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，進(jìn)樣測定，記錄石斛堿和內(nèi)標(biāo)峰面積，分別記為A1和B1。將空白血漿換為水，同法制備高、中、低質(zhì)量濃度的石斛堿+內(nèi)標(biāo)溶液，均平行制備5份，進(jìn)樣測定，記錄石斛堿和內(nèi)標(biāo)峰面積，分別記為A2和B2。按A1/A2×100%計算石斛堿的基質(zhì)效應(yīng)，B1/B2×100%計算內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表1。

表1 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果（n＝5）Tab 1Results of matrix effect（n＝5）

2.9 精密度和準(zhǔn)確度考察

取“2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，分別連續(xù)進(jìn)樣測定5次，計算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度，連續(xù)測定3 d，計算日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，分別考察15℃保存24 h，－70℃保存并反復(fù)凍融3次，以及－70℃保存15 d后樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。

圖2 石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的選擇離子圖Fig 2 Selected ion chromatogram of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

2.11 血漿樣品中石斛堿的濃度

按“2.4”項(xiàng)下方法處理給藥組小鼠的血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，計算血漿樣品中石斛堿的質(zhì)量濃度為（41.3±5.7）ng/mL（n＝12）。

表2 精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果Tab 2 Results of precision and accuracy tests

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果（n＝3）Tab 3Results of stability tests（n＝3）

2.12 一測多評法計算血漿樣品中石斛堿代謝產(chǎn)物M-250、M-280的濃度

按一測多評法，取“2.11”項(xiàng)下給藥組小鼠的血漿樣品，以石斛堿對照品為對照，按“2.5”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，按Wk＝fs/k×[（Ws×Ak）/As]計算其代謝產(chǎn)物 M-250、M-280的濃度。式中，Wk為待測物質(zhì)量濃度；fs/k為相對校正因子，此處為1.0；Ws為石斛堿對照品質(zhì)量濃度；As為石斛堿對照品峰面積；Ak為待測物峰面積。結(jié)果顯示，血漿樣品中石斛堿代謝產(chǎn)物M-250、M-280的質(zhì)量濃度分別為（493.0±73.1）、（41.4±3.0）ng/mL（n＝12）。

3 討論

在本課題組前期研究中，通過精確相對分子質(zhì)量和二級碎片離子信息，鑒定了石斛堿在人肝微粒體中Ⅰ相代謝的4個主要代謝產(chǎn)物M-250、M-262、M-280和M-296，以及Ⅱ相代謝的1個主要代謝產(chǎn)物M-440[10]。本文檢測了小鼠灌胃石斛堿后，血漿中石斛堿及其主要代謝產(chǎn)物M-250、M-280的濃度。但獲得石斛堿代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品，以及對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量還存在比較大的困難。因此，本研究借鑒了天然藥物質(zhì)量評價中的一測多評法，以其進(jìn)行兩種主要代謝產(chǎn)物M-250、M-280的定量研究。

一測多評法對于對照品難以得到的多指標(biāo)測定有其特殊的優(yōu)勢[11]，目前在天然藥物及其制劑的質(zhì)量評價中應(yīng)用已較成熟，如《美國藥典》34版中有25個天然藥物及制劑、《歐洲藥典》7.0版中有9個天然藥物、2015年版《中國藥典》（一部）中黃連及銀杏葉提取物等的質(zhì)量評價均采用該方法[12]。在多指標(biāo)檢測中，以某一組分的對照品為對照，建立與其他待測組分之間的fs/k（即RCF），計算其他組分的含量，公式為：fs/k＝（Wk×As）/（Ws×Ak）。式中，Wk為待測物質(zhì)量濃度；As為對照品峰面積；Ws為對照品質(zhì)量濃度；Ak為待測物峰面積。

結(jié)構(gòu)類型相同的化合物，RCF的值往往接近1，如2015年版《中國藥典》（一部）中黃連藥材各生物堿的RCF值均為1.0，可直接以鹽酸小檗堿對照品的峰面積為對照，分別計算小檗堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的含量?？紤]到石斛堿代謝產(chǎn)物M-250、M-280的結(jié)構(gòu)與石斛堿十分相似，如圖1，故暫定這兩個代謝產(chǎn)物的RCF值均為1.0，并以峰面積相當(dāng)?shù)氖鷫A對照品質(zhì)量濃度進(jìn)行計算。但上述推測還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究建立了一種靈敏、準(zhǔn)確，可用于小鼠血漿中石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的濃度測定的方法，為研究石斛堿的藥動學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：92.

[2]馬繼興.神農(nóng)本草經(jīng)輯注[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：37.

[3]王亞蕓，任建武.石斛堿的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，46（1）：152-158.

[4]陶鳳，金徽，楊貴忠，等.金釵石斛水提物對糖尿病大鼠腎組織非酶糖基化及氧化的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，50（10）：11-15、22.

[5]白金麗，溫淑香.金釵石斛提取物抗白內(nèi)障的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30（9）：57-59.

[6]劉名昆，李國慶.石斛提取物抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（23）：3571-3574.

[7]YANG S，GONG QH，WU Q，et al.Alkaloids enriched extract from Dendrobium nobile Lindl.attenuates tau protein hyperphosphorylation and apoptosis induced by lipopolysaccharide in rat brain[J].Phytomedicine，2014，21（5）：712-716.

[8]賓捷，胡余明，尹進(jìn)，等.金釵石斛對老齡小鼠抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，17（6）：1063-1064.

[9]姚寅.金釵石斛生物堿對老年癡呆癥的保護(hù)作用和機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥前沿，2013，2（4）：47-48.

[10]魯艷柳，黃思，汪敏，等.UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)鑒定石斛堿在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（4）：32-37.

[11]左嵐，孟勝男.一測多評法在中藥藥物分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥房，2016，27（18）：2589-2592.

[12]王欣，覃瑤，王德江，等.一測多評法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中成藥，2016，38（2）：395-402.