趙　利，郭玉君，艾力曼·馬合木提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心力衰竭科，烏魯木齊　830054)

MS、MSR基因多態(tài)性與靜脈血栓栓塞癥的相關(guān)性研究

趙利，郭玉君，艾力曼·馬合木提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心力衰竭科，烏魯木齊830054)

摘要：目的探討甲硫氨酸合酶(MS)、甲硫氨酸合酶還原酶(MSR)基因位點(diǎn)多態(tài)性與靜脈血栓栓塞癥(VTE)的關(guān)系。方法選擇2016年7月-2017年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院確診VTE的患者162例作為病例組，以同期住院的體檢無VTE、且性別及年齡相匹配的患者203例作為正常對(duì)照組，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)Hcy水平；應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-PFLP)技術(shù)檢測(cè)MS A2756G、MSR A66G位點(diǎn)多態(tài)性，分析基因位點(diǎn)多態(tài)性與VTE的關(guān)系。結(jié)果病例組的吸煙、腹型肥胖、高脂血癥人數(shù)多于正常對(duì)照組，BMI、腰圍、纖維蛋白原、D-二聚體、TG、Hcy、葉酸水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MSR A66G的隱性模型和等位基因分布頻率在病例組與正常對(duì)照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MSR A66G基因隱性模型不是VTE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而高Hcy血癥、吸煙、腹型肥胖是VTE的危險(xiǎn)因素。結(jié)論MS A2756G、MSR A66G基因多態(tài)性與VTE不存在相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：甲硫氨酸合酶；甲硫氨酸合酶還原酶；基因多態(tài)性；靜脈血栓栓塞癥

中圖分類號(hào)：R543.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2018)05-0576-06

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.013

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81560803)

作者簡(jiǎn)介：趙利(1983-)，女，博士，主治醫(yī)師，講師，研究方向：動(dòng)靜脈血栓栓塞。

通信作者：艾力曼·馬合木提，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)靜脈血栓栓塞，E-mail:598945190@qq.com。

本文引用：趙利，郭玉君，艾力曼·馬合木提.MS、MSR基因多態(tài)性與靜脈血栓栓塞癥的相關(guān)性研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,41(5):576-580,584.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.013

AssociationbetweenMS,MSRgenepolymorphismsandvenousthromboembolism

ZHAOLi，GUOYujun,AlimanMahemuti

(DepartmentofCardiacFailure，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between MS,MSR gene polymorphisms and venous thromboembolism(VTE).MethodsBy retrospective analysis,162 patients diagnosed as VTE in Department of Cardiac Failure of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University between July 2016 and December 2017 were selected,while 203 cases with gender and age matched were selected as control group,using enzyme-linked immunosorbent assay to detect the blood serum Hcy levels,and PCR-PFLP technique to detect MS A2756G and MSR A66G polymorphisms.ResultsSmoking,abdominal obesity and hyperlipidemia in the proportion of patients in the case group were higher than the normal control group.BMIs,waist circumference,fibrinogen,D-dimer,Triglyceride and folic acid levels in the case group were higher than those in the normal control group(P<0.05).MSR A66G recessive model and allele distribution frequency were significantly different between the case group and the normal control group(P<0.05).MSR A66G recessive model was not an independent risk factor for VTE,but hyperHcy,smoking and abdominal obesity are the risk factors for VTE.ConclusionThere were no correlations between MS A2756G,MSR A66G gene polymorphisms and VTE.

Keywords:methione synthas;methione synthase reductase;gene polymorphisms;venous thromboembolism

靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)是繼心血管疾病、腦卒中之后的第三大危害人類健康的疾病[1]。大約25%～50%的情況下沒有獲得性誘發(fā)因素的影響仍發(fā)生VTE。目前一致認(rèn)為同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是靜脈系統(tǒng)血栓形成的危險(xiǎn)因子。Hcy向蛋氨酸轉(zhuǎn)化的再甲基化通路中有三個(gè)關(guān)鍵酶：亞甲基四氫葉酸還原酶、甲硫氨酸合酶(Methione Synthase，MS)和甲硫氨酸合酶還原酶(Methione synthase reductase，MSR)，其中MS、MSR基因多態(tài)性與VTE的研究鮮有報(bào)道，結(jié)論存在分歧。本研究以VTE患者為主要研究對(duì)象,從基因水平分析MS及MSR基因位點(diǎn)多態(tài)性與VTE的關(guān)聯(lián),旨在發(fā)現(xiàn)VTE的高危風(fēng)險(xiǎn)模式，為臨床提供預(yù)警信息。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2016年7月-2017年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院確診VTE的患者162例作為病例組，以同期住院的體檢無VTE、且性別及年齡相匹配的患者203例作為正常對(duì)照組。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：VTE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：(1)放射性核素肺通氣-灌注掃描顯示肺灌注缺損和/或稀疏沿血管呈肺段分布，或呈楔形、凹形；肺通氣-灌注顯象不匹配。(2)肺動(dòng)脈CT顯示各級(jí)肺動(dòng)脈內(nèi)有阻塞和/或不規(guī)則偏心性充盈缺損。(3)肺動(dòng)脈造影征象肺動(dòng)脈及其分支充盈缺損；或栓子堵塞造成的截?cái)喱F(xiàn)象；或肺野無血流灌注，不對(duì)稱性肺血管紋理減少；或栓塞區(qū)出現(xiàn)“剪枝征”；肺動(dòng)脈分支充盈、排空延遲。(4)下肢血管超聲和/或放射性核素下肢深靜脈顯象下肢靜脈內(nèi)血栓征象。(5)獲得入選者知情同意并簽署知情書。正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無VTE家族史、無動(dòng)脈疾病(腦卒中、冠心病和周圍動(dòng)脈疾病)、無妊娠及腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：VTE組及對(duì)照組中臨床資料不全以及同時(shí)合并以下疾病，包括：(1)懷疑為惡性腫瘤、氣體、羊水或脂肪栓塞患者；(2)合并急、慢性病毒、細(xì)菌感染；(3)結(jié)締組織疾?。?4)創(chuàng)傷、手術(shù)、長(zhǎng)期制動(dòng)、口服避孕藥和肝、腎功能異常者；(5)患有血液系統(tǒng)疾病；(6)慢性阻塞性肺病；(7)急、慢性動(dòng)脈血栓栓塞患者；(8)未獲得知情同意者。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2方法依照調(diào)查問卷收集資料。體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)：BMI=體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。高血壓病按高血壓指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。2型糖尿病按照WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。腹型肥胖：女性腰圍>85cm，男性腰圍>90cm，即定義為腹型肥胖。高脂血癥按指南標(biāo)準(zhǔn)判斷[3]。吸煙者指每日吸煙超過5支，連續(xù)或累積吸煙者6個(gè)月或以上者。飲酒者是指周飲酒至少2次，連續(xù)飲酒1 a以上。生化指標(biāo)的檢測(cè)包括空腹血糖、血低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)、甘油三脂(Triglyceride，TG)，總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)、纖維蛋白原、D-二聚體等，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心統(tǒng)一檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELESA)法使用 Ultra-Mark 型酶聯(lián)儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)檢測(cè)血漿 Hcy 、葉酸、維生素B12的濃度，若血漿Hcy濃度>15 μmol/L時(shí)，定義為高同型半胱氨酸血癥(高Hcy血癥)。外周血白細(xì)胞抽提DNA：使用血液基因組 DNA中計(jì)量抽提試劑盒提取基因組DNA。聚合酶鏈反應(yīng)：首先在Pubmed網(wǎng)站Genebank欄目中查找并核對(duì)MS、MSR全基因序列，再以rs1805087、rs1801394的rs序列為參考，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)的上引物和下引物。PCR-RFLP分析:PCR擴(kuò)增條件：首先進(jìn)行的是預(yù)變性：95℃溫度下反應(yīng)5min；再按下列步驟循環(huán)反應(yīng)34次：95℃變性30s，退火30s(其中退火溫度分別為rs1805087為44.7℃、rs1801394為62℃，72℃延伸30s，末次循環(huán)后的PCR產(chǎn)物再經(jīng)72℃延伸5min，最后4℃冷卻1min即得到擴(kuò)增的雙鏈DNA。酶切實(shí)驗(yàn)及凝膠電泳基因型鑒定:rs1805087位點(diǎn)的內(nèi)切酶為Hae III、rs1801394位點(diǎn)的內(nèi)切酶為Nsp I。內(nèi)切酶反應(yīng)結(jié)束后，在2%瓊脂糖凝膠上電泳消化片段，由EB替代品染色劑完成，最后用凝膠成像系統(tǒng)判斷結(jié)果。各基因位點(diǎn)每個(gè)基因多態(tài)性分別抽取20個(gè)標(biāo)本進(jìn)行直接DNA測(cè)序。

2　結(jié)果

2.1病例組與正常對(duì)照組臨床資料的比較病例組的吸煙、腹型肥胖、高脂血癥人數(shù)多于正常對(duì)照組，BMI、腰圍、纖維蛋白原、D-二聚體、TG、Hcy、葉酸水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組的飲酒、高血壓、糖尿病、肌酐、TC、HDL、LDL、VitB12水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　病例組與正常對(duì)照組臨床資料的比較

2.2MS、MSR基因PCR擴(kuò)增及酶切結(jié)果MS基因A2756G突變位點(diǎn)擴(kuò)增后，經(jīng)Hae III酶切后，分為3種基因型：野生型AA型：僅有189bp一個(gè)條帶，雜合型AG型：有189bp、159bp、30bp三個(gè)條帶，突變型GG型：僅有159bp、30bp兩個(gè)條帶，見圖1、2。MSR基因A66G突變位點(diǎn)擴(kuò)增后，經(jīng)Nsp I酶切后，分為3種基因型：野生型AA型有126bp、25bp兩個(gè)片段；雜合型AG型有151bp、126bp和25bp三個(gè)片段，突變型GG型僅有151bp一個(gè)片段，見圖3、4。

圖1　MS基因A2756G多態(tài)性 PCR 產(chǎn)物各基因型酶切片段電泳結(jié)果

圖2　MS基因A2756G 多態(tài)性 PCR 產(chǎn)物測(cè)序圖(箭頭所指為突變位置堿基)

2.3MS、MSR多態(tài)基因性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)對(duì)MS、MSR突變的基因型頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)的病例組和正常對(duì)照組人群的各基因位點(diǎn)的基因型頻數(shù)分布與預(yù)期值相比較，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說明具有群體代表性，來自同一遺傳平衡體，見表2、3。

圖3　MSR基因A66G多態(tài)性PCR產(chǎn)物各基因型酶切片段電泳結(jié)果

表2　MS A2756G位點(diǎn)基因型頻率Hardy-Weinberg檢驗(yàn)

2.4MS、MSR基因多態(tài)性在病例組和正常對(duì)照組中的頻率分布MS A2756G、MSR A66G在病例組與正常對(duì)照組中的基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組的MS A2756G的顯性模型、隱性模型、相加模型、等位基因分布頻率和MSR A66G顯性模型、相加模型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MSR A66G的隱性模型和等位基因分布頻率在病例組與正常對(duì)照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表3　MSR A66G位點(diǎn)基因型頻率Hardy-Weinberg檢驗(yàn)

2.5MSRA66G隱性模型與VTE的非條件Logistic回歸分析為了控制VTE人群混雜因素的影響，以是否患有VTE(1=是，0=否)作為因變量，將是否為高Hcy血癥(1=是，0=否)，是否吸煙(1=是，0=否)，是否腹型肥胖(1=是，0=否)，是否為MSR A66G基因隱性模型(1=GG，0= AA + AG)作為自變量引入模型進(jìn)行非條件Logistic回歸分析，分析上述因素與VTE發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性。校正后，MSR A66G基因隱性模型不是VTE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而高Hcy血癥、吸煙、腹型肥胖是VTE的危險(xiǎn)因素，見表5。

表4　MS、MSR基因多態(tài)性在病例組和正常對(duì)照組中的頻率分布/例(%)

表5　MSR A66G隱性模型與VTE的非條件Logistic回歸分析

3　討論

VTE是一種高發(fā)病率、高病死率的疾病，是多種因素影響的結(jié)果，最主要方面為基因和環(huán)境因素相互作用。眾所周知，Hcy是靜脈血栓形成的危險(xiǎn)因子，血漿Hcy 的水平去除各種環(huán)境營(yíng)養(yǎng)因素影響，代謝酶的基因突變引起酶缺陷或活性下降從而導(dǎo)致Hcy升高是靜脈血栓發(fā)病的主要原因之一。Hcy代謝通路有三個(gè)關(guān)鍵酶：亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、MS和MSR。MTHFR基因多態(tài)性已明確與VTE發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。然而，MS和MSR基因多態(tài)性研究較少，且結(jié)論不一。MS和MSR基因突變是否能引起Hcy水平升高從而造成VTE發(fā)病增加，是本研究分析的目的。

MS 基因突變研究的較多的是MS A2756G 突變，A→G的突變可導(dǎo)致919 位密碼子D→G的錯(cuò)義突變，MS 2756G等位基因在不同人群中的頻率分別約為：馬來西亞為17.9%，日本為17.3%，西班牙為18.8%，高加索19.9%，中國(guó)8.5%，泰國(guó)11.8%，韓國(guó)13.1%；而突變頻率較高的是非洲23.8%，印度北部24%。在中國(guó)范圍內(nèi)，MS A2756G位點(diǎn)多態(tài)性分布在中國(guó)人群中以野生型AA為主，突變型GG等位基因低，具有中國(guó)人群的特征。MS基因A2756G 位點(diǎn)的突變與VTE的研究較少，Zoe等[4]研究表明，G等位基因分布頻率在病例組低于正常對(duì)照組，雜合子降低Hcy濃度，提示攜帶G等位基因減少VTE事件，可能是VTE的保護(hù)性因子。而Salomon等[5]和Yates等[6]的研究均顯示MS A2756G多態(tài)性不是VTE的危險(xiǎn)因子。本研究結(jié)果顯示，MS A2756G各基因型和各遺傳模型在病例組和正常對(duì)照組間的分布頻率都無差異，G等位基因頻率分布無差別，未顯現(xiàn)GG突變型在病例組的表達(dá)頻率多或少，故MS A2756G基因多態(tài)性與VTE不存在關(guān)聯(lián)，考慮可能與MS基因A2756G 位點(diǎn)突變未能引起血漿Hcy水平升高有關(guān)。

圖4　MSR基因A66G多態(tài)性 PCR 產(chǎn)物測(cè)序圖(箭頭所指為突變位置堿基)

MSR是保持MS活性的關(guān)鍵酶，其活性或濃度降低均可導(dǎo)致Hcy甲基化代謝途徑障礙，導(dǎo)致不同程度的Hcy濃度升高。目前研究較多的常見突變位點(diǎn)為MSR A66G。MSR A66G等位基因突變頻率在30%～50%，我國(guó)10省市人群66G等位基因頻率和G66G基因型頻率分別為25.7%和6.6%。Suzuki等[7]研究顯示，MSR A66G基因多態(tài)性與頭頸部腫瘤無關(guān)，但Zhang等[8]研究顯示，MSR 66AA型降低頭頸部腫瘤的發(fā)生，且等位基因A是保護(hù)性因子。Brown等[9]研究報(bào)道，MSR 66GG型患者調(diào)整了性別的干擾因素后有較高早發(fā)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，但無相應(yīng)的Hcy水平升高。多倫多大學(xué)一項(xiàng)研究[10]揭示，女性VTE患者的MSR 66GG型頻率高于對(duì)照組(32.55%比27.13%)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Naushad 等[11]研究顯示，MSR 66GG是下肢深靜脈血栓的危險(xiǎn)因子，且在MTHFR A1298C、C677TA雜合型并存時(shí)進(jìn)一步增加下肢深靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，病例組和正常對(duì)照組各基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)回歸分析顯示無關(guān)聯(lián)性，原因有：與VTE存在關(guān)聯(lián)的MSR突變基因可能不是A66G；MSR A66G基因多態(tài)性不升高Hcy水平，其與VTE可能不存在相關(guān)性，但不除外在增加樣本量的情況下出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量探討分析。

本研究結(jié)果顯示，高Hcy血癥、吸煙、腹型肥胖是VTE的危險(xiǎn)因素，與Walte等[12]、石朝利等[13]、胡雪梅等[14]研究結(jié)論一致。本研究在收集資料過程中嚴(yán)格納入標(biāo)準(zhǔn)，未能獲得充足的樣本例數(shù)，目前仍在收集高質(zhì)量的樣本，并進(jìn)行長(zhǎng)期的隨訪觀察，對(duì)Hcy代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性與VTE的預(yù)后研究提供參考。

綜上所述，血漿高Hcy、吸煙及腹型肥胖是VTE人群的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能與VTE的發(fā)生相關(guān)。MS A2756G、MSR A66G基因多態(tài)性不是VTE人群的遺傳易感因素。預(yù)防因不良生活方式導(dǎo)致的獲得性危險(xiǎn)因素，并預(yù)測(cè)和干預(yù)高危人群，對(duì)提高VTE患者生活質(zhì)量可起到重要臨床意義。識(shí)別與VTE相關(guān)的特殊突變基因，選擇性采取預(yù)防，一定程度上能夠及時(shí)給予治療，從而減少死亡的發(fā)生。

[收稿日期：2017-10-23]

(本文編輯王艷)