凡爾克·艾合買提江，美力班·吐爾遜，郭文濤，劉恒戈，阿仙姑·哈斯木

(新疆醫(yī)科大學(xué)1研究生學(xué)院;2附屬腫瘤醫(yī)院；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室，烏魯木齊　830011)

宮頸癌組織中Toll樣受體9和干擾素調(diào)節(jié)因子7蛋白表達與人乳頭狀瘤病毒感染的關(guān)系

凡爾克·艾合買提江1,2，美力班·吐爾遜3，郭文濤1，劉恒戈2，阿仙姑·哈斯木3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1研究生學(xué)院;2附屬腫瘤醫(yī)院；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室，烏魯木齊830011)

摘要：目的探討子宮頸病變中Toll樣受體9(TLR9)和干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)表達與人類乳頭狀病毒16(HPV16)感染的關(guān)系。方法以HPV-GenoCam-9600檢測46例宮頸癌，25例高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和23例慢性宮頸炎組織HPV感染及分型；采用Illumina Hiseq 4000測序平臺對15例宮頸病變組織進行轉(zhuǎn)錄組測序；通過免疫組化SP法檢測TLR9和IRF7在慢性宮頸炎、HSIL和宮頸癌患者石蠟包埋組織中的表達水平。結(jié)果HPV基因芯片分析結(jié)果顯示，在94例HPV陽性的標(biāo)本中共檢測到11個HPV基因型，在66例宮頸癌及癌前期病變中的10例為多重感染，多重感染率為15.1%(10/66)。3例HPV陽性的慢性宮頸炎組織中都是HPV16陽性。12個HPV基因型中高危型為10個，低危型2個。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，HPV16陽性的宮頸癌和HSIL組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達的基因有12個；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示TLR9和IRF7在HSIL和宮頸癌組織中高表達，其表達水平呈正相關(guān)(P<0.05)，但TLR9在HPV16陽性的宮頸病變組織中表達低于HPV16陰性的宮頸病變組織，且與IRF7蛋白表達呈正相關(guān)。結(jié)論TLR9和IRF7蛋白參與了子宮頸癌發(fā)生發(fā)展，但具體調(diào)控機制需要深入研究。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；Toll樣受體9；干擾素調(diào)節(jié)因子7；人乳頭狀瘤病毒16

中圖分類號：R737.33

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2018)05-0539-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.004

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81360332)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金-聯(lián)合基金(2017D01C227)

作者簡介：凡爾克·艾合買提江(1988-)，男，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。

通信作者：阿仙姑·哈斯木，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:婦科腫瘤,E-mail:axiangu75@126.com。

本文引用：凡爾克·艾合買提江，美力班·吐爾遜，郭文濤,等.宮頸癌組織中Toll樣受體9和干擾素調(diào)節(jié)因子7蛋白表達與人乳頭狀瘤病毒感染的關(guān)系[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018,41(5):539-542,547.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.004

RelationshipbetweentheexpressionofTLR9andIRF7proteinsandHPVinfectionincervicalcancer

FanerkeAihemaitijiang1,2,MeilibanTuerxun3,GUOWentao1,LIUHengge2,AxianguHasimu3

(1GraduateSchool;2TheAffiliatedTumorHospital;3DepartmentofPathologyandAnatomy,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of Toll like receptor 9(TLR9)and interferon regulatory factor 7(IRF7)and human papillomavirus16(HPV16)infection in female cervical lesions.Methods94cases of cervical cancer were detected by hpv-genocam-9600 to diagnose as 46 cased of cervical carcinoma,25 cases of high grade squamous intraepithelial lesions and 23 cases of chronic cervicitis;Illumina Hiseq 4000 sequen HSILg platform was used to sequence the transcriptome of 15 cases of cervical lesions.The expression of TLR9 and IRF7 in the paraffin embedded tissue of chronic cervicitis and cervical cancer was detected by immunohistochemical SP method.ResultsThe results of HPV gene chip analysis showed that 11 HPV genotypes were detected in 86 HPV positive specimens and 10 of 66 cervical cancer and precancerous lesions were multiple infections.The multiple infection rate was 15.10%(10/66).3 cased of HPV positive in chronic cervitis tissues were all HPV16 positive,and 10 of the 12 HPV genotypes were high-risk,and 2 were low-risk.The results of transcriptome sequenHSILg showed that there were 12 differentially expressed genes related to TLR9 in cervical carHSILoma and HSIL.Immunohistochemical results showed that TLR9 and IRF7 were highly expressed in HSIL and cervical cancer tissues,and the correlation between the expression levels of HSIL and IRF7 was positive(P<0.05).However,the expression of TLR9 in HPV16 positive cervical lesions was lower than that in HPV16 negative cervical lesions,and with positive correlation to IRF7 protein.ConclusionThe expression of TLR9 and IRF7 protein may be involved in the occurrence and development of cervical cancer in women.But the specific regulatory mechanisms need to be further studies.

Keywords:cervical cancer;Toll-like receptor 9(TLR9);Interferon regulatory factor 7(IRF7);human papillomavirus 16(HPV16)

Toll樣受體(toll like receptor，TLR)及其細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制誘導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)，同時可直接影響后續(xù)獲得性免疫系統(tǒng)。Toll樣受體9(TLR9)在許多腫瘤細胞系和腫瘤中出現(xiàn)表達或者上調(diào)表達，與腫瘤的發(fā)生、生長和發(fā)展密切相關(guān)，特別是在上皮來源的腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等惡性腫瘤及癌前病變[1]。干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)是產(chǎn)生 I型干擾素的重要調(diào)節(jié)因子，具有致癌和抑癌兩種特性，其對腫瘤形成的調(diào)控與腫瘤細胞的類型密切相關(guān)[2]。本研究旨在探討TLR9和IRF7蛋白在宮頸病變中的表達與HPV感染的關(guān)系，為宮頸癌臨床診治提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對象臨床標(biāo)本選擇新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015-2017年慢性宮頸炎、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和宮頸癌患者活檢組織標(biāo)本共94例，全部標(biāo)本甲醛固定，石蠟包埋。組織病理學(xué)診斷由病理醫(yī)師確診，其中慢性宮頸炎23例，HSIL25例，宮頸癌46例(高分化鱗癌26例，中低分化鱗癌20例)。采用免疫組織化學(xué)方法檢測蛋白表達，組織DNA的提取進行HPV芯片檢測分型。15例宮頸病變新鮮組織進行轉(zhuǎn)錄組測序(分別為正常宮頸HPV陰性、正常宮頸HPV16陽性、HSILHPV16陰性、HSIL HPV16陽性和宮頸癌HPV16陽性組織各3例)。

1.2方法

1.2.1人乳頭瘤病毒(HPV)分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)(HPV-GenoCam-9600)檢測宮頸病變組織按照試劑盒說明書提取組織DNA，并進DNA雜交和顯色，用HPV分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)對基因芯片檢測并分析。結(jié)果判斷：HPV分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)可自動檢測INS值(INS的參考值為11.0)，INS<11.0，HPV 陰性；INS≥11.0，HPV 陽性，并報告HPV型別。

1.2.2采用Illumina Hiseq 4000測序平臺對宮頸病變組織進行轉(zhuǎn)錄組測序提取總RNA和富集mRNA，從組織樣品中提取總RNA，利用Nanodrop 2000對所提RNA 的濃度和純度進行檢測。利用帶有Oligo(dT)的磁珠與ployA 進行A-T 堿基配對，從總RNA中分離出mRNA，加入fragmentation buffer，可以將mRNA 隨機斷裂成200bp左右的小片段，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，加入六堿基隨機引物(random hexamers)，以mRNA 為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cDNA，隨后進行二鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。連接adaptor和Illumina Hiseq 4000上機測序：雙鏈的cDNA 結(jié)構(gòu)為粘性末端，加入End Repair Mix 將其補成平末端，隨后在3’末端加上一個A 堿基，用于連接Y 字形的接頭，之后Illumina Hiseq測序平臺4000 上機測序。

1.2.3采用免疫組織化學(xué)法檢測TLR9和IRF7蛋白表達情況免疫組織化學(xué)SP法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，TLR9兔抗人多克隆抗體和IRF7兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測法，切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后微波爐抗原修復(fù)，滴加適量H2O2：阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后滴加一抗(TLR9、IRF7抗體濃度分別為1∶250、1∶500)，4℃冰箱過夜(以PBS作為陰性對照)。第2天加二抗(各步間隔PBS緩沖液沖洗10min)。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明封片。結(jié)果判斷采用雙盲法由兩位病理醫(yī)師分別觀察免疫組織化學(xué)結(jié)果，以陽性細胞數(shù)和染色程度為判斷標(biāo)準(zhǔn)。光學(xué)顯微鏡下全視野觀察，按陽性細胞數(shù)在上皮細胞內(nèi)所占比例分為4個分值，染色細胞數(shù)<5%視為0分，5%～25%為1分，26%～75%為2分；>75%者為3分。染色強度判定：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。綜合積分按公式計算：綜合積分=(染色細胞分數(shù)+染色強度分數(shù))/2。

(4)輸出重建信號和殘差信號。通常情況下，重建信號為原輸入信號中的低頻分量，殘差信號為原輸入信號中的高頻分量。

2　結(jié)果

2.1子宮頸病變中HPV感染和基因型分布在94例女性宮頸病變標(biāo)本經(jīng)內(nèi)參檢測后作了HPV的檢測，包括46例宮頸癌,25例高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL),23例慢性宮頸炎組織，見表1。

表1　子宮頸癌和HSIL中HPV基因型分布/例

2.2子宮頸病變中與HPV16感染和TLR9相關(guān)的差異表達基因前期項目采用Illumina Hiseq測序平臺4000完成女性宮頸病變組織的轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建Illumina PE文庫(200bp)進行2×151bp測序，對獲得的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，之后利用生物信息學(xué)手段對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，HPV16陽性的宮頸癌和HSIL組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達的基因有12個，見表2。

2.3TLR9和IRF7在宮頸炎組織、宮頸癌及HSIL組織中的表達及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系TLR9蛋白在宮頸炎組織、HSIL組織、宮頸癌組織中陽性表達率分別為34.8%，100%，50%。IRF7蛋白在宮頸炎組織、HSIL組織、宮頸癌組織中陽性表達率分別為47.8%，96%，23.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3，圖1。

表2　女性HPV16陽性宮頸癌和HSIL組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達的基因

2.4TLR9和IRF7在宮頸炎組織、宮頸癌組織及HSIL組織中的表達水平的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示，TLR9蛋白在宮頸病變組織中表達與IRF7表達呈正相關(guān)(r=0.373,P<0.05)。

圖1　TLR9和IRF7分別在宮頸癌組織、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)組織及宮頸炎組織中的表達(×200)

表3TLR9和IRF7在不同宮頸組織中的表達情況/例

分類例數(shù)TLR9陽性陰性χ2值P值IRF7陽性陰性χ2值P值宮頸炎組織238151112HSIL組織2525024.5850.00024133.6980.000宮頸癌組織4623231135

3　討論

宮頸癌的發(fā)生與高危型HPV感染密切相關(guān)[3]，而且具有族群易感性，提示遺傳和環(huán)境的交互作用導(dǎo)致的免疫失衡在宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。機體通過免疫應(yīng)答和免疫監(jiān)視清除入侵的病原體和惡變組織細胞。近期研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細胞表面也表達TLRs，并且TLRs信號有助于腫瘤的免疫逃逸和發(fā)展,說明各種TLRs的配體特異性可能被腫瘤生存和免疫逃逸所利用[5]。絕大部分TLRs共享MyD88介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,通過特異性配體的結(jié)合，TLRs發(fā)生構(gòu)象變化并被激活，將信號傳遞給下游效應(yīng)分子，引起一系列信號傳遞連鎖反應(yīng)，包括TRAF(s)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號傳遞，最終誘導(dǎo)各種炎癥趨化因子、細胞因子等靶基因表達和引起IRF-3的激活[6]。宮頸癌發(fā)生與HPV感染密切相關(guān)，那么HPV針對TLRs的配體特異性以及TLRs對天然免疫的介導(dǎo)作用，可能發(fā)生一系列防范機制。在我們前期研究工作中發(fā)現(xiàn)HPV16編碼的E6或E7蛋白對HLA-Ⅰ表達調(diào)控產(chǎn)生干擾作用[7]，但是其在TLRs及其天然免疫的影響，還沒有直接證據(jù)。分布在細胞內(nèi)體膜上的TLR 9在內(nèi)體發(fā)展成早期溶酶體和成熟溶酶體，此過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能依賴于酸性微環(huán)境，而HPV16 E5蛋白能夠抑制內(nèi)體的酸化和成熟過程。說明HPV16也與TLRs信號通路有關(guān)。同時HPV16 E5能夠引起HLA-Ⅰ在高爾基體滯留，影響其向細胞膜的轉(zhuǎn)運，干擾素(interferons，IFNs)就能夠解除這種抑制作用，而IFNs正是TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要效應(yīng)產(chǎn)物[8]。由于TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊有共享特征和網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性，以及宮頸癌和HPV免疫逃逸和生存策略的多樣性，只有通過多種TLRs相關(guān)的基因表達調(diào)控水平篩查分析，鑒別出宮頸癌特異性TLRs信號通路，才能深入開展TLRs介導(dǎo)的天然免疫與宮頸癌進程的相互作用機制研究，為TLRs特異的宮頸癌免疫治療和抗腫瘤藥物篩選奠定基礎(chǔ)。因此，本研究前期采用Illumina Hiseq測序平臺4000對子宮頸癌組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)IRF7是與HPV感染相關(guān)的TLR9靶基因。

IRF7是產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的重要調(diào)節(jié)因子，其在機體的大部分細胞不表達，但在病毒感染后誘導(dǎo)大量產(chǎn)生[9]。作為TLR9的激動劑CpG-ODN(非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸重復(fù)序列)，能識別和激活I(lǐng)RF7、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素表達，從而產(chǎn)生抗病毒作用[10]。作為TLR9的激動劑非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸重復(fù)序列(CpG-ODN)，能識別和激活I(lǐng)RF7、核因子κB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素表達，從而產(chǎn)生抗病毒作用。

研究通過免疫組織化學(xué)染色法檢測炎癥組、HSIL組、宮頸癌組標(biāo)本共94例，其中宮頸癌組46例，HSIL組25例，宮頸炎癥組23例。發(fā)現(xiàn)TLR9蛋白的表達從慢性宮頸炎到宮頸癌的發(fā)生呈逐漸上升的改變(P<0.05)。由此說明TLR9參與了宮頸癌發(fā)生、發(fā)展進程。發(fā)現(xiàn)IRF7蛋白在宮頸炎組織、HSIL組織、宮頸癌組織中陽性表達率分別為47.8%、96%、23.9%。提示IRF7在宮頸癌組織中相對其他2組對比呈現(xiàn)低表達。對比TLR9與IRF7在這3組的表達情況發(fā)現(xiàn)在HSIL組織中TLR9和IRF7表達最高，在宮頸癌組織中TLR9相對IRF7表達較高，2個指標(biāo)在宮頸癌的惡變過程中表達有差異，這有可能與樣本量較小有一定關(guān)系。提示TLR9和IRF7表達下調(diào)與宮頸組織發(fā)生惡性轉(zhuǎn)換有一定的關(guān)聯(lián)性[11]，從而說明通過干預(yù)TLR9和IRF7的表達可能預(yù)防宮頸組織惡變的作用。也有研究證實，IRF7活性能夠促進巨噬細胞的抗腫瘤效應(yīng)，在乳腺癌和結(jié)腸癌細胞的巨噬細胞中，轉(zhuǎn)染具有IRF7組成型活性形式的腺病毒，明顯抑制了腫瘤細胞的增殖[12]，而且通過IRF7轉(zhuǎn)染后的巨噬細胞中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等促癌基因表達下調(diào)，而抑癌效應(yīng)分子I型IFN，TRAIL等表達上調(diào)，表明IRF7基因可能增強了巨噬細胞的抗腫瘤特性而減弱了其促癌的作用。另外，在原發(fā)性乳腺癌患者中，IRF7高表達能夠明顯延長無骨轉(zhuǎn)移的生存時間；而且在乳腺癌小鼠模型中增強IRF7的表達并不會增加原發(fā)腫瘤的增長率，但是過表達IRF7能夠明顯的減少腫瘤的骨轉(zhuǎn)移[13]。由此進一步說明TLR9和IRF7參于了腫瘤的發(fā)生及病變的進展。但由于標(biāo)本例數(shù)的限制以及宮頸癌和HPV免疫逃逸和生存策略的多樣性TLR9、IRF7在腫瘤發(fā)生發(fā)展及宮頸病變過程的具體作用還需要通過擴大樣本例數(shù)來進一步研究。TLR9、IRF7異常表達在腫瘤細胞組織和不同宮頸組織中，提示可與腫瘤和宮頸病變發(fā)生及進展中可能發(fā)揮重要作用。

[收稿日期：2018-02-27]

(本文編輯楊晨晨)