李曉華,邱龍新,林志鋒,楊小燕,3

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建 龍巖 364012;2.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 龍巖 364012;3.福建省生豬疫病防控工程研究中心,福建 龍巖 364012)

副豬嗜血桿菌(Hps)主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。剖檢具纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等病變表現(xiàn)。副豬嗜血桿菌一共有15個(gè)血清型,其中血清4型和5型是中國(guó)乃至世界各地較流行的血清型[1]。該病已成為全球養(yǎng)豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病,其危害日益嚴(yán)重。

近年來,該菌對(duì)抗生素的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重,常用藥物對(duì)該病已無明顯療效,而且,隨著人們對(duì)無藥物殘留、綠色食品需求的期望越來越高,抗生素在本病預(yù)防和控制等方面的應(yīng)用受到嚴(yán)格限制和逐步禁止[2]。因此,接種疫苗已成為預(yù)防和控制該病最為有效的方法之一。在副豬嗜血桿菌滅活苗研制中,選用能顯著提高體液免疫作用的佐劑對(duì)提高疫苗的效力起著重要作用[3]。

銀杏(Ginkgo biloba)是世界上最古老的孑遺植物,銀杏葉被用作藥物已有500余年的歷史[4]。近年來,銀杏葉及銀杏葉提取物(EGB)已廣泛應(yīng)用于禽、豬等生產(chǎn)試驗(yàn)研究。但在有關(guān)銀杏葉及EGB應(yīng)用于疫苗中的試驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。為此,本試驗(yàn)通過EGB中銀杏葉黃酮苷對(duì)副豬嗜血桿滅活疫苗免疫仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+/CD8+)以及血清TFN-α含量影響情況的探討,旨在為銀杏葉黃酮苷在疫苗方面的的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株 副豬嗜血桿菌血清5型 LY02分離株2013年8月分離自龍巖市某發(fā)病豬場(chǎng),由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠;體重 25 g,購(gòu)自福建吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;15日齡仔豬,購(gòu)自閩西某規(guī)?；i場(chǎng)。豬瘟、藍(lán)耳病抗體水平均合格,偽狂犬病gE抗體檢測(cè)陰性。

1.1.3試劑 大豆-酪蛋白消化物瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、瓊脂糖,均購(gòu)自O(shè)XOID公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;小牛血清,購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司;銀杏提取物(EGB),購(gòu)自德國(guó)威瑪舒培博士藥廠(其中,銀杏提取物原液每毫升含銀杏黃酮苷9.6 mg,萜內(nèi)酯1.47 mg);TFN-α檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司;Hps抗體試劑盒,購(gòu)自北京飛凱生物技術(shù)有限公司。

1.2副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗制備

1.2.1副豬嗜血桿菌菌液的制備 將保存的 LY02分離株復(fù)壯后,接種于 TSB液體培養(yǎng)基,37℃180 r/min搖床培養(yǎng)12 h作為種子液,再將種子液按1%體積比接種于另外3瓶TSB培養(yǎng)基中,37℃180 r/min搖床培養(yǎng) 18 h,測(cè) OD600值,計(jì)算活菌含量。

1.2.2菌液的滅活 按菌液總體積加入0.4%甲醛,置37℃搖床中滅活,24 h后取滅活菌液于TSA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng),檢驗(yàn)是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.3佐劑疫苗的制備 佐劑疫苗的水相制備:用PBS將滅活菌液充分洗滌3次后離心,用 PBS稀釋總菌含量濃度至5.0×109CFU/mL,將不同濃度銀杏葉提取物黃酮苷與菌液混合制備為佐劑疫苗水相(見表1)。

佐劑疫苗的油相制備:取白油94份,加入6份司本-80,充分?jǐn)嚢杈鶆?高壓滅菌121℃、20 min,冷卻到室溫備用。

佐劑疫苗的乳化:水相與油相按1∶1.5比例乳化,制作成油包水滅活苗,檢驗(yàn)物理性狀,合格于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3小鼠佐劑疫苗免疫試驗(yàn) 將50只小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別免疫高、中、低3個(gè)濃度銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗,同時(shí),設(shè)立不加佐劑普通多價(jià)苗和注射生理鹽水陰性對(duì)照。首免,分別通過肌肉注射含佐劑滅活菌苗0.2 mL/只,空白對(duì)照組注射同等劑量生理鹽水,2周后二免,免疫途徑和劑量同首免,二免1周后用副豬嗜血桿菌桿菌血清5型強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒,攻毒方式為腹腔注射菌液0.5 mL/頭,活菌含量為 2.0 × 109CFU,連續(xù)觀察 2周(見表2)。

1.4仔豬佐劑疫苗免疫試驗(yàn) 將25只15日齡仔豬隨機(jī)分為5組,每組5只,分別通過頸部肌肉注射含佐劑滅活菌苗及不含佐劑普通滅活苗各2mL/頭,陰性對(duì)照組注射生理鹽水,首免14 d后進(jìn)行二免,免疫途徑和劑量同首免,二免后14 d后,用副豬嗜血桿菌桿菌血清5型強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒,攻毒方式為腹腔注射菌液3 mL/頭,活菌含量為7.5×109CFU(見表3)。

表2　副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗小鼠免疫攻毒試驗(yàn)

表3　副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗仔豬免疫攻毒試驗(yàn)

1.5血樣采集 分別在28、35、42日齡時(shí)采集仔豬前腔靜脈血。4 000 r/min離心25 min分離血清,-70℃冷凍保存?zhèn)溆?28、35日齡仔豬采血另一部分用肝素鈉作抗凝劑用于T細(xì)胞亞群流式檢測(cè)。

1.6TFN-α水平檢測(cè) 參照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.7T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) 按張紅英等[8]方法,每管加入經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)確定體積的 CD3ε單克隆抗體3 μL、CD4a 2 μL、CD8a 3 μL,然后加入肝素鈉抗凝血100 μL,室溫避光作用20 min,加入溶血素0.5 mL,室溫避光作用10 min,1 500 r/min離心10 min,吸去上清,用PBS洗滌3次后,1%多聚甲醛重懸細(xì)胞,進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.8組織切片的制作與觀察 采集攻毒后感染死亡豬和免疫保護(hù)豬的肺臟、肝臟、腎臟、心臟等組織,浸泡于10%福爾馬林溶液中,按常規(guī)方法進(jìn)行脫水、包埋、切片等處理,制作石蠟組織切片,H.E.染色后顯微鏡下觀察病理變化。

1.9數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,試驗(yàn)結(jié)果以Means±SD表示,當(dāng)P＜0.05時(shí)差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒結(jié)果

2.1.1小鼠攻毒結(jié)果 小鼠攻毒后4 h小鼠開始出現(xiàn)被毛凌亂、扎堆、顫抖、不進(jìn)食等臨床癥狀,其中非免對(duì)照組最為嚴(yán)重;攻毒后14 h左右部分小鼠開始死亡,未死亡小鼠出現(xiàn)了眼睛發(fā)紅,有黏性的分泌物,拉稀、呼吸急促、不活動(dòng)等癥狀;攻毒后48 h,未死亡小鼠恢復(fù)正?；顒?dòng),眼睛發(fā)紅、拉稀等癥狀消失。空白對(duì)照組無出現(xiàn)死亡,生理活動(dòng)正常(見表4)。

表4　小鼠副豬嗜血桿菌5型(Hps)攻毒結(jié)果

2.1.2仔豬攻毒結(jié)果 陰性對(duì)照組:攻毒6 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,于攻毒29 h后全部死亡;疫苗對(duì)照組:攻毒8 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,于攻毒36 h后全部死亡;高濃度組:攻毒14 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,攻毒33 h后死亡4頭仔豬;中濃度組:攻毒23 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,攻毒46 h后死亡2頭仔豬;低濃度組:攻毒15 h后出現(xiàn)靜臥,3 d后精神恢復(fù),全部存活(見表5)。

表5　仔豬副豬嗜血桿菌5型(Hps)攻毒結(jié)果

試驗(yàn)組仔豬臨床剖檢,感染死亡的仔豬普遍出現(xiàn)心包炎、胸腔積液、腹腔積液、關(guān)節(jié)積液、肺臟纖維素性滲出嚴(yán)重、胸腔粘連等副豬嗜血桿菌感染典型病理變化,而免疫保護(hù)組仔豬心、胸腔、腹腔、關(guān)節(jié)、肺臟均無明顯病理變化。

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1感染組仔豬組織學(xué)病理變化結(jié)果 肺臟表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎變化,肺泡間質(zhì)增寬增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡內(nèi)充滿紅細(xì)胞,肺泡結(jié)構(gòu)縮小甚至消失(見中插彩版圖1A);肝細(xì)胞水泡變性、細(xì)胞核溶解,胞漿淡染,竇狀隙擴(kuò)張,內(nèi)充滿炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞,有漿液-纖維素性滲出物(見中插彩版圖1B);腎小管上皮細(xì)胞脫落管間有出血,腎小球濃縮,腎小囊上皮細(xì)胞脫落,細(xì)胞核濃縮(見中插彩版圖1C);心肌纖維萎縮,部分心肌纖維胞漿溶解、斷裂,心肌纖維間有少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)(見中插彩版圖1D)。

2.2.2免疫保護(hù)組仔豬的病理學(xué)觀察結(jié)果 免疫保護(hù)組仔豬的病理學(xué)觀察結(jié)果,肺臟(見中插彩版圖2A),心臟(見中插彩版圖2D),肝臟(見中插彩版圖2C)和腎臟(見中插彩版圖2B)等無明顯的病理變化。

2.3副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗免疫仔豬Hps抗體水平的影響 Hps抗體檢測(cè)結(jié)果,攻毒后1周(35日齡),銀杏葉黃酮苷中濃度和低濃度組的仔豬血清Hps抗體值均顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.05),而高濃度組差異不顯著,相對(duì)于陰性對(duì)照組,添加黃酮苷佐劑中濃度Hps抗體值顯著增高(P＜0.01);低濃度組的Hps抗體值差異顯著(P＜0.05)(見表6)。

表6　副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗免疫仔豬Hps抗體水平

2.4銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬血清中TNF-α含量的影響 銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬血清中TNF-α含量檢測(cè)結(jié)果,二免后1周(28日齡),銀杏葉黃酮苷低濃度組的TNF-α含量顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.05);攻毒后1周(35日齡),銀杏葉黃酮苷低濃度組的TNF-α含量極顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.001),高濃度和中濃度組仔豬TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);攻毒后2周(42日齡),高、中、低3個(gè)濃度的TNF-α含量均有顯著提高(P＜0.05),以低濃度組提高最顯著(P＜0.001)(見表7)。

表7　銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬血清中TNF-α含量的影響

2.5銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 銀杏葉黃酮苷不同濃度組 CD4+、CD8+含量檢測(cè),在二免后1周(28日齡),銀杏葉黃酮苷中濃度和低濃度組均可升高外周血中的CD4+淋巴細(xì)胞亞群的比例,其中中濃度組顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.001),低濃度組顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.05);僅有銀杏葉黃酮苷高濃度組可升高外周血中的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)照疫苗組,效果極顯著(P＜0.001),銀杏葉黃酮苷佐劑對(duì)外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例也有明顯的提高作用,其中中、低濃度組效果顯著(P＜0.05)。在攻毒后1周(35日齡),銀杏葉黃酮苷3個(gè)濃度組均可升高外周血中的CD4+淋巴細(xì)胞亞群的比例,效果都極顯著高于疫苗對(duì)照組 (P＜0.001),對(duì)外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例也有明顯的提高作用,效果都極顯著高于疫苗對(duì)照組 (P＜0.001),但對(duì)于外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例,均未升高(見表8)。

表8　銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量變化

3　分析與討論

3.1本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),疫苗中加入銀杏葉黃酮苷,能提高仔豬對(duì)副豬嗜血桿菌血清5型強(qiáng)毒株的攻毒保護(hù)。不同濃度保護(hù)率表現(xiàn)各有不同,高濃度組仔豬保護(hù)率為20%,中濃度組仔豬保護(hù)率為40%,低濃度組仔豬保護(hù)率為100%,說明在副豬嗜血桿菌疫苗中添加一定濃度的銀杏葉黃酮苷可提高保護(hù)率,以低濃度(1.4 mg/mL)添加量,保護(hù)效果最好。

3.2體液免疫是B細(xì)胞介導(dǎo)的一種重要的免疫反應(yīng),血清中抗體水平為評(píng)估其免疫狀況的重要指標(biāo)之一。EGB能促進(jìn)抗體的生成,增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能[5]。黃其春、楊小燕[6]等對(duì)銀杏葉提取物調(diào)節(jié)斷奶仔豬免疫功能的研究發(fā)現(xiàn),EGB能增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能、淋巴細(xì)胞活性及腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力,能夠增強(qiáng)斷奶仔豬的體液免疫功能。對(duì)實(shí)驗(yàn)仔豬在35日齡(攻毒后1周)采血檢測(cè)血清中Hps抗體水平。結(jié)果表明,銀杏葉黃酮苷中、低濃度組的仔豬血清Hps抗體值均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而高濃度組差異不顯著,說明中、低濃度銀杏葉黃酮苷與Hps菌株滅活苗配合使用,能顯著提高疫苗免疫效力。

3.3TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起著重要作用。王國(guó)棟[7]等發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對(duì)大鼠肝臟來源的Kc的TNF-α及其蛋白質(zhì)表達(dá)呈濃度依賴性,隨著銀杏葉提取物的濃度的增加,TNF-α mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸減少,本試驗(yàn)對(duì)銀杏葉黃酮苷不同濃度組TNF-α含量檢測(cè)結(jié)果顯示,各日齡中,二免后1周(28日齡)檢測(cè)結(jié)果,以低濃度組TNF-α含量顯著高于對(duì)照組,攻毒后1周(35日齡)和攻毒后2周(42日齡)檢測(cè)結(jié)果,低濃度組TNF-α含量極顯著高于對(duì)照組,高、中濃度組顯著高于對(duì)照組。

3.4細(xì)胞免疫是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體另一種重要的免疫反應(yīng),通過檢測(cè)動(dòng)物T淋巴細(xì)胞數(shù)目,可以了解動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫狀況[8]。EGB能增加T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡,對(duì)細(xì)胞免疫具有促進(jìn)作用。CD 4+亞群是輔助性T淋巴細(xì)胞(Th/Ti)的標(biāo)志。這兩類細(xì)胞都直接參與特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),而且Th/Ti細(xì)胞對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)起激發(fā)調(diào)控作用[9]。郝璐(2016)[10]等通過銀杏葉提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖和分泌功能的影響研究發(fā)現(xiàn),EGB在一定劑量范圍內(nèi)能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,能提高脾淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的比值。本試驗(yàn)通過對(duì)銀杏葉黃酮苷不同濃度組CD4+、CD8+含量檢測(cè),結(jié)果表明,在二免及攻毒后1周,在副豬嗜血桿菌疫苗中添加一定濃度的銀杏葉黃酮苷,可升高外周血中的 CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例,對(duì)外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例也有明顯的提高作用,但對(duì)于外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例,均未升高。熊平源等(2012)[11]采用間接免疫熒光法測(cè)定EGB對(duì)小鼠CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGB能降低CD4-CD8+的百分率,呈反向調(diào)節(jié)作用。在本試驗(yàn)中EGB對(duì)CD8+是否也呈現(xiàn)反向調(diào)節(jié)作用,有待進(jìn)一步開展研究。