隋 明,張崇軍,岳文喜,朱克永,李俊儒,張鳳英

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川 都江堰 611830;2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,四川 成都 610065)

隨著人們生活水平的提高,肉、蛋、奶等多種畜產(chǎn)品成為生活中不可缺失的主要食品材料,由于肉、蛋、奶等多種畜產(chǎn)品病原菌污染,而導(dǎo)致食物中毒事件頻繁發(fā)生,食品安全問題成為人們關(guān)注的熱點,尤其是沙門菌的中毒最為嚴重,因此,沙門菌是肉、蛋、奶等多種畜產(chǎn)品污染中常見的食源性致病菌[1]。沙門菌屬于腸桿菌科菌中一種無莢膜及芽孢的革蘭陰性桿菌,血清型復(fù)雜眾多,血清型有2 500多種并屬于46個血清型,廣泛存在環(huán)境中,可以引起人和多種動物發(fā)病,成為重要人獸共患病原菌[2-3]。沙門菌主要有O抗原、K抗原、Vi抗原3種抗原結(jié)構(gòu),沙門菌的血清型分型根據(jù)其菌體表面的抗原物質(zhì)與特性血清產(chǎn)生的免疫反應(yīng)進行鑒別與區(qū)分,血清型分型的方法具有很多種,常用方法是用標準的沙門菌診斷血清進行玻板凝集試驗,有些菌株需要連續(xù)誘導(dǎo)后,確定用鞭毛第2相和H抗原型別,根據(jù)Kauffman-White血清分型標準,確定每株菌的血清型別[4-5]。相關(guān)研究表明了食物細菌性中毒70%～80%由沙門菌引起,據(jù)統(tǒng)計在食物中毒病例中由沙門菌引起的食品中毒占第一位,其中肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品是引起人們沙門菌中毒主要的食品來源[6-7]。動物在屠宰加工過程中易受到沙門菌污染,因此,對冷鮮肉等食品中沙門菌檢測具有重要意義。本試驗從都江堰地區(qū)冷鮮肉食品加工廠、超市等采集冷鮮肉食品樣品53份對沙門菌檢測,分離到了30株沙門菌,對分離測到的30株沙門菌進行了致病性、血清分型、耐藥性等檢測與分析。為該地區(qū)冷鮮肉中沙門菌的防控提供依據(jù)。

1　材料

1.1材料來源 從都江堰地區(qū)采集冷鮮肉食品樣品(豬肉、雞肉、鴨肉、其他)53份(表1)。

表1　冷鮮肉樣品來源

1.2主要試劑與儀器 緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、WS培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、革蘭染色液試劑盒,均購自青島海博生物技術(shù)有限公司;ID32E腸道菌鑒定試紙條,購自bioMerieuxsa公司;沙門菌診斷血清,購自蘭州生物制品研究所;藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司);2×TaqMaster Mix、DM-2 000 Marker,購自北京賽百盛生物技術(shù)有限責任公司;沙門菌屬診斷血清,購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;VITEK2型全自動細菌鑒定系統(tǒng)由法國生物梅里埃公司生產(chǎn);、提供隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);常規(guī)的試劑及主要儀器均由本實驗室提供。

1.3實驗動物 體重22 g左右健康昆明系小鼠155只,購自北京維通利華實驗動物有限公司。

2　方法

2.1細菌的分離與培養(yǎng) 將采集53份冷鮮肉食品樣品參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗沙門菌檢驗》標準進行處理[8]。將處理好樣品無菌條件下接種SC增菌液中,37℃培養(yǎng)18～24 h,取增菌液分別接種于BS培養(yǎng)基和WS培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng),37℃培養(yǎng)18～24 h;挑取BS培養(yǎng)基和WS培養(yǎng)基上單個優(yōu)勢菌落接種營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng),進行革蘭染色鏡檢。

2.2細菌生化鑒定 取純化培養(yǎng)的分離菌株,按照說明書接種到ID32E腸道菌鑒定試紙條中,37℃培養(yǎng)24 h,用VITEK2型全自動細菌鑒定系統(tǒng)對分離的30株分離菌株進行生化鑒定。

2.3細菌的PCR鑒定 參考文獻[9],根據(jù)沙門菌毒力基因序列設(shè)計特異性引物invAF:5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′R:5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取純化培養(yǎng)的分離菌株,用水煮法提取分離菌株的基因組DNA,以基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)。PCR擴增反應(yīng)體系(50 μL):2 ×TaqMarker Mix 25 μL,ddH2O 21 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s,65℃退火30 s,72℃延伸50 s,72℃終延伸10 min,共30個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶,將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序,測序結(jié)果與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進行同源性比對。

2.4動物致病性試驗 將純化培養(yǎng)的30株沙門菌分離菌株,調(diào)整濃度為1×107CFU/mL。每一株菌分離菌株用灌胃方式接種5只小鼠,劑量為0.25 mL(1×107CFU/mL),空白對照組接種等量無菌的生理鹽水,在攻毒后的12 h,觀察7 d,記錄小鼠的發(fā)病情況、及死亡的情況,對于死亡的小鼠進行細菌分離鑒定。

2.5細菌血清型分型檢測 參考文獻[10-11],用標準的沙門菌診斷血清進行玻板凝集試驗檢測,從冷鮮肉食品中分離的30株沙門菌分離菌株血清型分型,有些菌株需要連續(xù)誘導(dǎo)后,確定用鞭毛第2相和H抗原型別,根據(jù)Kauffman-White血清分型標準,確定每株菌的血清型別。

2.6藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作和結(jié)果判斷[12]。

3　結(jié)果與分析

3.1細菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 從采集120份冷鮮肉食品樣品接種到SC增菌液,30份樣品分離到病原菌,將增菌液分別接種到BS培養(yǎng)基和WS培養(yǎng)基上進行鑒別培養(yǎng),結(jié)果顯示,30株病原菌均在在BS培養(yǎng)基上長出產(chǎn)H2S的黑色帶金屬光澤的菌落,不產(chǎn)H2S形成灰綠色菌落;WS培養(yǎng)基上藍色的菌落,產(chǎn)H2S的菌落中心為黑色。染色鏡檢可見兩端略圓的直桿狀革蘭陰性菌。與沙門菌培養(yǎng)特性和形態(tài)特征一致。

3.2細菌的生化試驗結(jié)果 30株分離菌株均發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽;不發(fā)酵乳糖、蔗糖、尿素;吲哚試驗呈陰性,賴氨酸羧酶陽性,產(chǎn)生H2S。經(jīng)VITEK2型全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定為沙門菌,評定結(jié)果合格率為98.5% ～99.9%。

3.3細菌PCR鑒定結(jié)果 30株分離菌株用沙門菌特異性引物invA均擴增到285 bp左右大小的目的基因片段(見圖1),測序結(jié)果與GenBank中的登錄的沙門菌參考菌株同源性在98.9% ～99.9%之間,從而證實了30株分離菌株均為沙門菌。

圖1　部分分離菌株P(guān)CR檢測結(jié)果

3.4動物致病性試驗結(jié)果 攻毒的試驗小鼠在24～48 h后出現(xiàn)不同程度的死亡,對死亡的小鼠,無菌采集病料組織進行分離鑒定,結(jié)果顯示,在死亡的小鼠的肝臟中分離到了沙門菌。未攻毒對照組的小鼠健康存活,根據(jù)統(tǒng)計24株沙門菌分離菌株對小鼠具有很強的致病性。

3.5血清型分型檢測結(jié)果 由表2可知,從冷鮮肉樣品中分離到的30株沙門菌,檢出了8種不同的血清型,其中以豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌為主要流行血清型,分別占分離菌株的23.3%、20.0%、20.0%。

表2　冷鮮肉中沙門菌血清型分型檢測結(jié)果

3.6藥敏試驗結(jié)果 由表3可知,從冷鮮肉樣品中分離的30株沙門菌,耐藥性嚴重,呈現(xiàn)多重耐藥。其中,對阿莫西林、氨芐西林、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、環(huán)丙沙星、多粘菌素6種藥物耐藥性比較嚴重,耐藥率在50.0% ～100%之間;對林可霉素、慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星4種藥物的耐藥率在40.0% ～46.7%之間;對頭孢曲松、阿米卡星2種藥物的耐藥性較低在30.0% ～33.3 之間。

表3　冷鮮肉中沙門菌分離株藥敏試驗結(jié)果

4　討論

沙門菌是重要的人獸共患病原菌,廣泛存在環(huán)境中,可以通過多種途徑污染肉、蛋、奶等多種畜產(chǎn)品,成為了主要的食源性致病菌之一,沙門菌引起食物中毒成為人們關(guān)注的熱點[13]。本試驗從都江堰地區(qū)冷鮮肉食品加工廠、超市等采集冷鮮肉食品樣品53份中,檢測出30株沙門菌分離菌株,通過人工感染小鼠驗證其致病性,結(jié)果顯示,24株沙門菌為致病性菌株。因而證實了該地區(qū)冷鮮肉食品加工廠、超市等采集冷鮮肉食品中沙門菌污染嚴重,均具有很強的致病性。造成冷鮮肉食品被沙門菌污染原因可能在于動物在屠宰加工過程中受到沙門菌污染。因此,在冷鮮肉加工過程中應(yīng)引起注意。王海源[14]研究表明,從鮮肉食品中分離到沙門菌對小鼠具有很強的致病性。侯雪嬌[15]研究表明了廣西地區(qū)鮮肉食品中以沙門菌污染為主。因此,沙門菌成為了污染冷鮮肉食品主要的病原菌之一,應(yīng)引起重視。

沙門菌具有多種血清型,不同血清型可以感染不同的宿主對象,因為受到環(huán)境和宿主影響,其血清型具有一定的差異性[16]。本試驗結(jié)果顯示,分離的30株沙門菌包括8種血清型,其中以豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌為主要流行血清型,分別占分離菌株的23.3%、20%、20%。從而證實該地區(qū)冷鮮肉食品中沙門菌流行的血清型復(fù)雜,呈現(xiàn)多樣性分布。孫吉昌等[10]報道了從江西省主要地區(qū)零售畜禽肉中分離到了136株沙門菌,德爾卑沙門菌、火雞沙門菌、鼠傷寒沙門菌和阿貢納沙門菌為主要流行血清型。趙志偉等[16]報道了2009-2010年廣西南寧市市售新鮮畜禽食品中檢出了德比(S.derby)、雞(S.gallinarum)、傷寒(S.typhi)等血清型的沙門菌。與試驗存在一定的差異性,可能與地區(qū)有關(guān),不同地區(qū)流行的沙門菌血清型不同。

在臨床中由于抗生素的不合理的使用,沙門菌對抗生素的耐藥率呈上升趨勢,沙門菌耐藥性可以通過食物鏈傳播到人群,對公共衛(wèi)生安全造成嚴重的危害[17]。相關(guān)研究表明了食源性沙門菌的耐藥性不斷增強,尤其是肉雞在屠宰加工過程中,沙門菌的耐藥性轉(zhuǎn)移到雞肉食品中,且與污染率呈正相關(guān)[18]。本試驗?zāi)退幮越Y(jié)果表明,30株沙門菌分離菌株對阿莫西林、氨芐西林、新霉素等6種藥物耐藥性比較嚴重,耐藥率在50.0% ～100%之間,且呈現(xiàn)多重耐藥性。從而證實了該地區(qū)冷鮮肉食品中沙門菌耐藥性嚴重,應(yīng)引起重視。本試驗為該地區(qū)冷鮮肉中沙門菌的防控提供依據(jù)。