代淑梅，李秋園*

（中溶科技股份有限公司研發(fā)中心 河北省非糧乙醇工程技術(shù)研究中心，河北 唐山 064000）

目前全球能源供應(yīng)日益緊張，從國家能源和戰(zhàn)略安全考慮，研究新型能源替代石油尤為迫切，而通過發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是一種重要的可再生能源獲得途徑。一直以來，乙醇作為一種潔凈的燃料備受關(guān)注，無論是單獨(dú)作為汽車的燃料，還是部分替代燃油，都被認(rèn)為是最合適的化石燃料替代物。我國是世界最大的馬鈴薯生產(chǎn)國，馬鈴薯來源廣，且其塊莖含有豐富的淀粉（約占其干質(zhì)量的60%～80%），經(jīng)處理后是天然良好的培養(yǎng)基[1]。因此，利用其發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇是可行的。目前國內(nèi)外對(duì)發(fā)酵馬鈴薯產(chǎn)乙醇工藝研究較多，在低濃度底物條件下，乙醇產(chǎn)量可達(dá)到6.20%vol，發(fā)酵率可達(dá)82.0%[2]；在高底物濃度條件下，乙醇產(chǎn)量可達(dá)16.61%vol[3]；同時(shí)還有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了同步糖化發(fā)酵工藝的研究[4]。但工藝優(yōu)化主要關(guān)注溫度、pH、培養(yǎng)基配方等常規(guī)參數(shù)，對(duì)酶系復(fù)配對(duì)乙醇產(chǎn)量影響的研究不多，因此本試驗(yàn)在繼續(xù)深入對(duì)馬鈴薯液體發(fā)酵生產(chǎn)乙醇各影響因子的考察及其工藝優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上，通過對(duì)不同酶系復(fù)配比例的研究，以廉價(jià)培養(yǎng)基，結(jié)合相關(guān)工藝參數(shù)的優(yōu)化，尋找提高馬鈴薯液體發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的最優(yōu)條件，提高乙醇產(chǎn)率，縮短發(fā)酵周期，從而降低乙醇的生產(chǎn)成本，為我國馬鈴薯發(fā)展乙醇產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯干粉：市售鮮馬鈴薯經(jīng)60℃烘干后粉碎；耐高溫淀粉酶（10 000 U/g）、糖化酶（4 500 U/g）、纖維素酶（6 000 U/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；活性干酵母：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；泡敵（優(yōu)級(jí)品）：廣州恒宇化工有限公司；尿素（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WHL-65B立式干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；0.40 mm孔篩：紹興市上虞道墟燕光儀器設(shè)備廠；GC-7890氣相色譜儀：上海傳昊儀器有限公司；BS-2F振蕩培養(yǎng)箱：金壇區(qū)水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

料水比對(duì)乙醇發(fā)酵的影響：稱取120 g馬鈴薯干粉過0.40mm孔篩，以不同的料水比（1∶4.0、1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5、1∶6.0g∶mL））加入500 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)pH值至5.0，在65 ℃條件下分別加入50 U/g耐高溫淀粉酶、糖化酶和纖維素酶，處理1h后，向其中加入0.43g尿素，0.06%泡敵消泡劑，于115℃條件下濕熱滅菌20 min，接入已活化的酵母菌，于30℃培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵72 h時(shí)發(fā)酵液中乙醇含量。

酶制劑添加量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響：按1.3.1部分確定的最佳料水比，在相同條件下分別添加不同量的耐高溫淀粉酶10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g、30 U/g）、糖化酶（120 U/g、140 U/g、160 U/g、180 U/g、200 U/g）和纖維素酶（5 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g），測(cè)定發(fā)酵72 h時(shí)發(fā)酵液中乙醇含量。

發(fā)酵溫度對(duì)乙醇發(fā)酵的影響：在確定的最佳料水比和酶制劑添加量的條件下，按同樣的處理方法分別于不同溫度條件下（27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃）進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定72 h時(shí)發(fā)酵液中乙醇含量。

消泡劑添加量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響：在確定的最佳料水比、酶制劑添加量及發(fā)酵溫度的條件下，按同樣的處理方法進(jìn)行培養(yǎng)，分別加入不同量的消泡劑（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%），測(cè)定發(fā)酵72 h時(shí)發(fā)酵液中乙醇含量。

酵母接種量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響：在已確定的最佳條件下，向發(fā)酵液中接入不同接種量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）的酵母菌，測(cè)定發(fā)酵72 h時(shí)發(fā)酵液中乙醇含量。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇發(fā)酵的影響：在已確定的最佳條件下，于不同時(shí)間（48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量。

1.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料水比（A）、發(fā)酵溫度（B）、酵母接種量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為考察因素，以發(fā)酵液中乙醇含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of fermentation conditions

1.3.3 測(cè)定方法

乙醇含量和淀粉轉(zhuǎn)化率的測(cè)定按照參考文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料水比對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

在馬鈴薯的發(fā)酵過程中影響比較大的因素是加水量。在乙醇生產(chǎn)過程中，要求醪液均勻，黏度低，易于輸送和酵母發(fā)酵。但隨著固形物含量的提高，醪液的黏度迅速增加，會(huì)使醪液的攪拌、輸送、加熱和冷卻都十分困難。同時(shí)水也是反應(yīng)物之一，在原料分子周圍沒有足夠的水參與反應(yīng)，最終造成醪液液化和糊化反應(yīng)不均勻和不徹底，引起原料利用率下降，因此，選擇合適的料水比是實(shí)現(xiàn)馬鈴薯乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵一步[6]。

圖1 料水比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.1 Effect of material to water ratio on ethanol production

由圖1可知，當(dāng)料水比為1∶4.0（g∶mL）時(shí)，發(fā)酵液中乙醇含量最高。隨著料水比進(jìn)一步增大，乙醇含量呈現(xiàn)先緩慢后加快下降的趨勢(shì)；淀粉轉(zhuǎn)化率呈先快速后緩慢上升的趨勢(shì)[2]。綜合可知，料水比為1∶5.0（g∶mL）時(shí)乙醇含量和淀粉轉(zhuǎn)化率均較高，因此選擇料水比為1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5（g∶mL）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 酶制劑添加量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

酶制劑添加量的多少直接影響發(fā)酵的效果。酶制劑添加量太少，導(dǎo)致淀粉糖化速度慢或糖化不完全，不利于發(fā)酵；若酶制劑添加量太多，又造成浪費(fèi)提高生產(chǎn)成本。

圖2 耐高溫淀粉酶添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.2 Effect of high temperature resistant amylase addition on ethanol production

由圖2可知，添加耐高溫淀粉酶后，馬鈴薯中的淀粉鏈被水解為糊精和葡萄糖，從而使淀粉漿的黏度降低，有利于產(chǎn)乙醇發(fā)酵。在耐高溫淀粉酶添加量為15 U/g時(shí)，乙醇含量最高。當(dāng)耐高溫淀粉酶添加量＞15 U/g后，乙醇含量變化不大?？紤]到發(fā)酵成本，因此選擇耐高溫淀粉酶添加量為15 U/g較為適宜。

圖3 糖化酶添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.3 Effect of glucoamylase addition on ethanol production

糖化酶添加量直接影響乙醇發(fā)酵過程。糖化酶添加量過少，則糖化不完全，不利于提高淀粉的利用率；糖化酶添加量過多，葡萄糖糖濃度過高會(huì)對(duì)酵母的發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，影響酒精的生成，延長發(fā)酵生產(chǎn)的周期[7]。由圖3可知，糖化酶添加量較低時(shí)，發(fā)酵液中乙醇含量隨糖化酶添加量的增加而增大。當(dāng)糖化酶添加量達(dá)到160 U/g后，乙醇含量變化不大。推測(cè)是因?yàn)樘腔柑砑恿枯^低時(shí)，糖化速度較慢，導(dǎo)致糖化和發(fā)酵都不完全。糖化酶添加量較高后會(huì)使發(fā)酵前期速度加快，對(duì)最終的乙醇含量基本沒有影響[7]?？紤]到發(fā)酵生產(chǎn)成本，因此選擇糖化酶添加量為160U/g較為適宜。

圖4 纖維素酶添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.4 Effect of cellulase addition on ethanol production

由圖4可知，隨著纖維素酶添加量的增加，發(fā)酵液中乙醇含量增大。但當(dāng)其添加量超過10 U/g后，乙醇含量變化不大?？紤]到生產(chǎn)成本，選擇纖維素酶添加量為10 U/g較為適宜。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

溫度是酵母發(fā)酵產(chǎn)酒的一個(gè)重要指標(biāo)，也對(duì)酵母體內(nèi)產(chǎn)酒相關(guān)酶系的形成和活性有重要影響。

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中乙醇含量相應(yīng)增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，乙醇含量達(dá)到最大；繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，乙醇含量反而降低。因此選擇發(fā)酵溫度為29℃、30℃、31℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on ethanol production

2.1.4 消泡劑添加量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

泡沫產(chǎn)生與噴料問題是發(fā)酵過程中遇到比較大的問題，在加入消泡劑后該問題能得到很大的改善，但是過多的消泡劑可能對(duì)乙醇發(fā)酵的過程產(chǎn)生抑制作用。

圖6 消泡劑添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.6 Effect of defoaming agent addition on ethanol production

由圖6可知，消泡劑添加量從0.02%增至0.06%時(shí)，發(fā)酵液中乙醇含量也隨之增加，雖然增長幅度不明顯，但能有效抑制發(fā)酵過程中泡沫的產(chǎn)生及噴料現(xiàn)象。當(dāng)消泡劑的用量繼續(xù)增加時(shí)，乙醇含量開始出現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)。因此選擇添加0.06%的消泡劑較為適宜。

2.1.5 酵母接種量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

發(fā)酵過程中，酵母的活性受到接種量大小的影響[8-10]。接種量過小，酵母菌數(shù)量不足，繁殖代數(shù)增多，容易老化和染菌；接種量過大，酵母菌老化嚴(yán)重，影響乙醇的發(fā)酵。

由圖7可知，在酵母接種量為0.2%～0.4%時(shí)，乙醇含量隨酵母接種量的增加而增大。當(dāng)接種量超過0.4%時(shí)，乙醇含量有所下降，原因可能過高的接種量引起酵母菌種老化直接影響到乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。因此選擇酵母接種量0.2%、0.4%、0.6%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖7 酵母接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.7 Effect of yeast inoculum on ethanol production

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

整個(gè)發(fā)酵過程中另一個(gè)對(duì)產(chǎn)酒量有重要影響因素就是發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵時(shí)間太短，可發(fā)酵性糖的利用不完全，殘?zhí)橇扛?，原料利用率低；發(fā)酵時(shí)間過長，則會(huì)引起產(chǎn)物分解，乙醇揮發(fā)，不利于分離，而且容易產(chǎn)生酸敗，產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物抑制發(fā)酵的進(jìn)行[11-15]。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.8 Effect of fermentation time on ethanol production

由圖8可知，發(fā)酵時(shí)間48 h時(shí)乙醇含量較低；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，乙醇含量有所增加，發(fā)酵時(shí)間72 h時(shí)乙醇含量較高；但發(fā)酵72 h后乙醇含量增加比較緩慢。因此選擇發(fā)酵時(shí)間60 h、72 h、84 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

續(xù)表

由表2可知，影響馬鈴薯乙醇發(fā)酵條件的主次因素排序?yàn)锳＞B＞C＞D，即料水比影響最大，其次是發(fā)酵溫度和接種量，發(fā)酵時(shí)間影響最??；比較k值大小可知，馬鈴薯發(fā)酵乙醇的最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即料水比為1:5.0（g∶mL），酵母接種量為0.4%，在31℃條件下發(fā)酵84h。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵液中乙醇含量為9.06%vol。

3 結(jié)論

本研究通過單因素及正交試驗(yàn)對(duì)馬鈴薯處理液發(fā)酵制乙醇工藝進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定出馬鈴薯糖化發(fā)酵制乙醇優(yōu)化工藝條件為發(fā)酵溫度31 ℃，料水比1∶5.0（g∶mL），耐高溫淀粉酶添加量15 U/g、糖化酶添加量160 U/g、纖維素酶添加量10 U/g，酵母接種量0.6%、發(fā)酵時(shí)間為84 h，在此條件下優(yōu)化后的發(fā)酵液中乙醇含量可達(dá)到9.06%vol。

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