李 嫄，趙 靜，余忠姝，曾 梅，張景勍

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016)

多年生草本姜黃素(curcumine, CM)是一種從姜黃根莖中提取的酚類活性物質(zhì)，廣泛種植于熱帶南亞和東南亞國家[1]。許多研究表明其毒性低，在抗腫瘤方面的潛力巨大[2]。CM對所有類型的肺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，如非小細(xì)胞肺癌A549和H1975細(xì)胞、大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞、肺鱗狀細(xì)胞癌Calu-1細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌H446和H187[3]。然而，水溶性差和快速降解引起生物利用度低，因此，提高CM的生物利用度對臨床應(yīng)用具有重要意義[4]。脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層形成的、內(nèi)部包含藥物的封閉囊泡，具有緩釋、靶向性、組織相容等優(yōu)點。殼聚糖為天然高分子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和黏附性[5-6]，可用于脂質(zhì)體的包衣，以增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和靶向性。近年來，殼聚糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用不僅包括止血、抗菌、人造組織器官等研究，還被廣泛用作藥物載體材料[7-8]。本文初步考察了殼聚糖包衣姜黃素脂質(zhì)體(chitosan coated curcumin liposomes, CMLP-CS)的體外釋藥特征及大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為，以期促進(jìn)CM吸收，提高其生物利用度，并為進(jìn)一步研究CMLP-CS口服給藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1藥物與試劑CM(規(guī)格：10 mg，西安帥諾生物科技有限公司)；蛋黃卵磷脂(規(guī)格：500 mg，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；膽固醇(規(guī)格：500 mg，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；尼群地平(純度>99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；殼聚糖(脫乙酰度95%，規(guī)格1 g，浙江金殼生物化學(xué)有限公司)；乙腈、乙醇等均為色譜純，實驗用水均為超純水。

1.2儀器LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；T-6新世紀(jì)紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Nano-ZS90型馬爾文粒徑測定儀(英國馬爾文公司)。

1.3實驗動物12只SD健康大鼠，♂，體質(zhì)量(230±20)g，動物使用許可證號：SYXK(渝)2015-0001，重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

2 方法

2.1CMLP-CS的制備采用薄膜分散法制備姜黃素脂質(zhì)體[9]。稱取處方量的磷脂、膽固醇和姜黃素于梨形瓶中，用無水乙醇超聲溶解后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇，在瓶壁形成均勻類脂薄膜。再加入適量磷酸鹽緩沖液 (pH 6.8 PBS)，45℃旋轉(zhuǎn)水合60 min使膜溶解，探頭超聲5 min，即得姜黃素脂質(zhì)體。將得到的上述脂質(zhì)體初懸液10 mL，緩慢滴加到一定體積的2 g·L-1CS溶液中，再繼續(xù)攪拌120 min(700 r·min-1)，冷卻至室溫，4℃冰箱靜置保存。

2.2體外釋放動力學(xué)動態(tài)透析法考察CMLP-CS和CM的體外釋藥特點。將同濃度的CMLP-CS和CM各1 mL分別投進(jìn)預(yù)先處理好的透析袋，將透析袋分別投入兩種釋放介質(zhì)(pH 1.2 HCl； pH 6.8 PBS)中，平行操作3份，于水浴恒溫震蕩(37℃，100 r·min-1)，分別于不同時間點取出1 mL釋放介質(zhì)，同時補充等溫等體積的釋放介質(zhì)[10]。測定取出的釋放介質(zhì)中CM的紫外吸光度，計算CM濃度，繪制釋放曲線，并采用相似因子法對釋放曲線進(jìn)行評價。

2.3大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)

2.3.1給藥方案與樣品采集 將♂ SD大鼠禁食12 h，自由飲水，隨機分為2組，分別灌胃給予CMLP-CS、CM(給藥劑量均為45.0 mg·kg-1)，給藥后于不同時間點大鼠眼眶取血500 μL，6 000 r·min-1離心10 min(離心管已經(jīng)過肝素預(yù)處理)，取上層血漿于-20℃冰箱保存。

2.3.2血漿樣品處理方法 取200 μL待測血漿樣品，加入80 μL尼群地平內(nèi)標(biāo)工作液(5 mg·L-1)，乙酸乙酯萃取2次，每次加入500 μL乙酸乙酯，渦旋震蕩5 min后，12 000 r·min-1離心10 min，合并有機相后用氮氣揮干，加入100 μL流動相復(fù)溶，吸取20 μL復(fù)溶液進(jìn)樣[12]。

2.3.3樣品測定方法的建立 色譜柱為伊利特C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)；流動相為乙腈 ∶5%冰乙酸溶液=55 ∶45(V/V)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為430 nm；柱溫為30℃。稱取CM 10 mg，乙醇溶解并定容至50 mL，得200 mg·L-1CM儲備液。取空白血漿200 μL，用CM儲備液配制濃度分別為15、25、50、75、100、200、400 μg·L-1的CM系列血漿溶液，各取20 μL進(jìn)樣記錄峰面積[12]。以CM和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)Ss/Si，以CM濃度為橫坐標(biāo)c，做線性回歸，并計算其回歸方程。

2.3.4方法學(xué)考察 取空白血漿，制備高、中、低(400、200、50 μg·L-1)3個濃度的CM血漿樣品，考察精密度，萃取回收率和方法回收率[12]。

2.3.5數(shù)據(jù)分析 通過DAS 2.1.1軟件計算和分析數(shù)據(jù)，對CMLP-CS和CM的AUC(0～72h)及cmax等主要藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析，進(jìn)行90%可信限考察，Tmax采用非參數(shù)統(tǒng)計Wilcoxon檢驗，評價CMLP-CS和游離CM是否具有生物等效性(α=0.05)。

3 結(jié)果

3.1體外測定方法經(jīng)考察，制備的CMLP-CS的平均粒徑約為550 nm，平均Zeta電位為23 mV，包封率約為78%。體外標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.1468X-0.0094，R=0.9999。CM溶液的濃度在0.5～8 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好。日內(nèi)精密度RSD分別為2.58%、2.03%、1.93%，日間精密度RSD分別為2.67%、3.44%、2.91%，均符合方法學(xué)要求。

3.2體外釋放動力學(xué)

3.2.1體外釋放曲線 CMLP-CS和CM在兩種釋放介質(zhì)中的體外釋放曲線，見Fig 1。CMLP-CS在pH 1.2 HCl和pH 6.8 PBS中，48 h內(nèi)為快速釋放期，累積釋放率分別為(64.99±0.65)%和(63.34±1.23)%，48 h后緩慢并持續(xù)釋放。在148 h時，CMLP-CS在pH 1.2 HCl和pH 6.8 PBS中的累積釋放率分別為(70.48±0.50)%和(72.35±1.04)%，分別是游離CM的1.8倍和2.6倍。結(jié)果表明，CMLP-CS明顯提高了體外釋放率，可改善體外釋藥行為。

3.2.2溶出曲線評價 采用相似因子法[14]評價溶出曲線，經(jīng)計算得到的相似因子見Tab 1。CMLP-CS與CM分別在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子小于50，提示釋放行為不相似，兩者之間沒有明顯差異。此外，CM在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子大于50，CMLP-CS在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子大于50，提示它們在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中釋放行為相似，而且兩者之間沒有差異，上述結(jié)果與Fig 1描述一致。

Fig 1 Drug release curve of CMLP-CS and CM in pH 6.8 PBS(A) and pH 1.2 HCl(B)

Formulation 1 anddissolution mediaFormulation 2 and dissolution mediaSimilarityfactorCM, pH 1.2 HClCMLP-CS, pH 1.2 HCl35.69CM, pH 6.8 PBSCMLP-CS, pH 6.8 PBS33.23CM, pH 1.2 HClCM, pH 6.8 PBS88.29CMLP-CS, pH 1.2 HClCMLP-CS, pH 6.8 PBS89.87

3.3大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究

3.3.1測定方法的建立 對濃度c與S(Ss/Si，待測血漿樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：S=0.010 5c+0.123 3，r=0.9970，CM在15～400 μg·L-1濃度范圍內(nèi)線性良好，最低檢測限(S/N=3)為5 μg·L-1。該方法在CM低、中、高3個濃度的日內(nèi)精密度RSD和日間精密度RSD均小于5%，均符合生物樣品分析要求[12]，其萃取回收率和方法學(xué)回收率符合含量測定方法要求。

3.3.2藥動學(xué)參數(shù) CMLP-CS和游離CM的平均血藥濃度-時間曲線，見Fig 2。經(jīng)DAS 2.1.1軟件計算分析，主要藥動學(xué)參數(shù)見Tab 2。Fig 2顯示，CM和CMLP-CS分別在0.25 h和3 h時達(dá)到了最大血藥濃度，可知CMLP-CS的達(dá)峰時間Tmax是CM的12倍，CMLP-CS的cmax值也明顯大于CM，說明與CM相比，CMLP-CS具有更長的釋放時間，表現(xiàn)出緩釋作用。CMLP-CS的曲線下面積AUC遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CM，表明CMLP-CS其在體內(nèi)的吸收效果明顯優(yōu)于CM，口服生物利用度更好。由Tab 2計算可知，CMLP-CS的AUC(0～72h)值約為CM的8.9倍，CMLP-CS的相對生物利用度為846.5%，CMLP-CS明顯提高了CM的體內(nèi)口服生物利用度。CMET的MRT(0～72h)大于CM，其值為CM的3.7倍，說明CMLP-CS能夠克服CM在體內(nèi)被迅速消除的缺點，延長在體內(nèi)的作用時間，從而利于提高生物利用度。

Fig 2 Mean concentration-time curves of CMLP-CS andfree CM with oral administration (n=6)

Main parameterCMLP-CSCMAUC(0～72 h)/μg·L-1·h-1606.20±93.5867.76±22.12MRT(0～72 h)/h8.23±04.622.24±0.28Cmax/μg·L-1108.71±4.4670.27±11.67Tmax/h3.00±0.000.25±0.00VRT(0～72 h)/h298.87±36.105.41±1.87T1/2/h7.44±1.032.55±0.25

3.3.3生物等效性 由Tab 3可知，CMLP-CS與游離CM的AUC(0～72 h)、AUC(0～∞)兩個參數(shù)的90%可置信區(qū)間均不在生物等效性標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間范圍內(nèi)，因此CMLP-CS與游離CM生物等效性不合格。另外，對達(dá)峰時間Tmax進(jìn)行非參數(shù)統(tǒng)計Wilcoxon檢驗，結(jié)果顯示，CMLP-CS和CM的達(dá)峰時間Tmax差異具有顯著性(P<0.05)。按照生物等效性的判定標(biāo)準(zhǔn)，CMLP-CS與CM生物不等效，CMLP-CS的藥效學(xué)標(biāo)準(zhǔn)高于CM。

Tab 3 The bioequivalence comparison of CMLP-CS andCM with oral administration, respectively

4 討論

姜黃素是一類溶解性低、滲透性高的藥物，其口服生物利用度低。本文采用經(jīng)典的薄膜分散法制備CM納米脂質(zhì)體，可改善藥物的溶解性，并在脂質(zhì)體的表面包覆有天然多糖殼聚糖，其生物相容性好、黏附性強，能夠打開胃腸道上皮細(xì)胞的膜孔，促進(jìn)大分子穿過上皮組織的轉(zhuǎn)運，并通過黏附作用延長脂質(zhì)體在體內(nèi)的滯留時間，從而提高生物利用度。

本文將CM制備成CMLP-CS后，在相同的釋放介質(zhì)中，48 h以前CMLP-CS的釋放速率略快于CM，其原因可能是少部分未包封的CM與兩親性的磷脂結(jié)合快速釋放，而48 h后，游離的CM的累積釋放率已達(dá)到最高，藥物釋放已接近飽和，而CMLP-CS仍然持續(xù)釋放藥物至148 h，具有良好的緩釋效果。其原因可能是包載在親水中心的CM不僅需要穿過磷脂雙分子層，還需要穿過脂質(zhì)體表面的殼聚糖包衣從而進(jìn)行釋放，雙重“屏障”可能是其緩釋作用的主要原因。

在體內(nèi)藥代動力學(xué)研究中，CMLP-CS和CM的藥時曲線均出現(xiàn)了雙峰。CM的藥時曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象可能是由于CM經(jīng)口服后在體內(nèi)快速向組織分布，其中一部分在肝脾等器官中蓄積后再次釋放入血。而CMLP-CS的藥時曲線出現(xiàn)雙峰的原因可能如下：(1)未包封的CM快速入血，包封在脂質(zhì)體內(nèi)的CM由于需要穿過磷脂和殼聚糖雙重屏障而達(dá)到持續(xù)釋放入血，從而達(dá)到最大血藥濃度；(2)具有生物黏附性的殼聚糖增加藥物與胃腸道接觸的面積與時間，從而延長了藥物的釋放時間。藥時曲線和主要藥代參數(shù)均表明，CMLP-CS可明顯提高CM的在體內(nèi)的口服生物利用度，其表現(xiàn)出的緩效長效作用與體外釋放動力學(xué)考察的結(jié)果一致。綜上所述，CMLP-CS可增加體外釋藥量，改善體外釋放行為，明顯提高姜黃素的口服生物利用度，具有良好的促進(jìn)吸收作用，為進(jìn)一步研究姜黃素口服納米制劑提供了理論基礎(chǔ)。

[1] Wanninger S, Lorenz V, Subhan A, et al. Metal complexes of curcumin-synthetic strategies, structures and medicinal applications[J].ChemSocRev, 2015,15： 4986-5002.

[2] Zhang W, Chen C, Shi H, et al. Curcumin is a biologically active copper chelator with antitumor activity[J].Phytomedicine, 2016,23(1):1-8.

[3] Heger M, van Golen R F, Broekgaarden M, et al. The molecular basis for the pharmacokinetics and pharmacodynamics of curcumin and its metabolites in relation to cancer[J].PharmacolRev, 2014,66： 222-307.

[4] Patil S, Choudhary B, Rathore A, et al. Enhanced oral bioavailability and anticancer activity of novel curcumin loaded mixed micelles in human lung cancer cells[J].Phytomedicine, 2015,22(12):1103-11.

[5] 于夢迪,王明霞,王海東. 姜黃素逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌分子靶向藥物耐藥的研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2017,33(12):1633-7.

[5] Yu M D, Wang M X, Wang H D, et al. Research progress of curcumin in reversing the drug resistance of non-small cell lung cancer[J].ChinPharmacolBull, 2017,33(12):1633-7.

[6] 李昕陽，謝 輝，嚴(yán)國俊. 殼聚糖衍生物在生物黏附藥物傳輸系統(tǒng)中的研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2014,49(23):2053-7.

[6] Li X Y, Xie H, Yan G J. Progress in research of chitosan derivatives in bioadhesive drug delivery system[J].ChinPharmJ, 2014,49(23):2053-7.

[7] 廖 紅,董 志,朱 毅,等. 殼聚糖對大鼠Ⅲ度燒傷創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報,2008,24(7):947-50.

[7] Liao H, Dong Z, Zhu Y, et al. Changes of the biological behavior of dermal fibroblasts in III skin burns wound in rats using chitosan[J].ChinPharmacolBull, 2008,24(7):947-50.

[8] 焦延鵬，李立華，羅丙紅，等. 殼聚糖對骨組織工程中組織修復(fù)的影響[J]. 中國材料進(jìn)展, 2012,31(9):35-9.

[8] Jiao Y P, Li L H, Luo B H, et aL. Effect of chitosan on tissue repair in bone tissue engineering[J].MaterialsChina, 2012,31(9):35-9.

[9] Muzzarelli R A, El Mehtedi M, Bottegoni C, et al. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone[J].MarDrugs, 2015,13(12):7314-38.

[10] 曾 梅,鐘 萌,馮 悅,等. 陽離子阿奇霉素微類脂體體內(nèi)外相關(guān)性[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2017,33(12):1713-7.

[10] Zeng M, Zhong M, Feng Y, et al.Invivoandinvitrocorrelation of azithromycin cationic micron niosomes[J].ChinPharmacolBull, 2017,33(12):1713-7.

[11] 袁譽銘，陳學(xué)梁，陳 靜，等. 溴吡斯的明新型納米乳體外釋放和大鼠在體胃腸吸收[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2017,33(2):276-9.

[11] Yuan Y M, Chen X L, Chen J, et al. Preliminary research on drug releaseinvitroand intestinal absorption of pyridostigmine bromide nanoemulsion in the rats[J].ChinPharmacolBull, 2017,33(2):276-9.

[12] 趙 靜，李 嫄，石明芯，等. 姜黃素乙醇脂質(zhì)體大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2017,48(2):290-4.

[12] Zhao J, Li Y, Shi M X, et al. Pharmacokinetics of curcumin ethosomes in ratsinvivo[J].JSichuanUniv(MedSciEd), 2017,48(2):290-4.

[13] 陳賢春，吳 清，王玉蓉，等. 關(guān)于溶出曲線比較和評價方法[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2007,27(5):662-4.

[13] Chen X C, Wu Q, Wang Y R, et al. Comparison and evaluation of dissolution curve[J].ChinJHospPharm, 2007,27(5):662-4.

[14] 畢文杰，穆小靜，祖麗皮艷·阿布力米特. 姜黃素新型靶向制劑研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2015,50(4):323-9.

[14] Bi W J, Mu X J, Abulimite ZLPY. Progress in targeting-delivery systems for curcumin[J].ChinPharmJ, 2015,50(4):323-9.

[15] Tan Q, Liu S, Chrn X, et al. Design and evaluation of a novel evodiamine-phospholipid complex for improved oral bioavailability[J].AAPSPharmSciTech, 2012,13(2): 534-47.