， 坤華， ， ， ，

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園， 南寧 530023； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 南寧 530023；3.廣西林業(yè)勘測(cè)設(shè)計(jì)院， 南寧 530023)

白及是我國常用中藥材，為蘭科植物白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.]的干燥塊莖，別名白根、地螺絲、白雞兒、白雞娃、連及草、羊角七等。產(chǎn)陜西南部、甘肅東南部、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川和貴州[1]。生于海拔100～3 200 m的常綠闊葉林下、棟樹林或針葉林下、路邊草叢或巖石縫中，朝鮮半島和日本也有分布。白及味苦、甘，性涼，有補(bǔ)肺止血、消腫生肌的功效，是白百抗癆顆粒、百貝益肺膠囊、結(jié)核丸、千山活血膏、傷科靈噴霧劑等多種中成藥的主要原料。近年來，白及還廣泛應(yīng)用于食品、日用品和化工品等方面。此外，由于白及花大色艷，具有較高的觀賞價(jià)值，許多地方已將其作為園林花卉植物廣泛栽培[2]。

隨著生活水平的提高和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，白及藥用需求和景觀需求都不斷增加。由于多年無節(jié)制的采挖以及生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞，野生白及資源已瀕臨枯竭，因此，快速繁殖白及幼苗以挽救白及資源迫在眉睫[3]。傳統(tǒng)的人工栽培通常采用分株繁殖，其繁殖效率較低，周期長，不適宜用于商業(yè)化的規(guī)模種植，無法滿足市場(chǎng)需求。所以具有繁殖速度快、周期短、可人工控制培養(yǎng)條件、管理方便等優(yōu)點(diǎn)的植物組織培養(yǎng)技術(shù)是白及快速繁殖方法的重要選擇。鑒于此，本研究從白及組培外植體的選擇、消毒方法、培養(yǎng)基、激素的選擇以及煉苗移栽等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建立組織培養(yǎng)及無性系，為白及的組培快繁及產(chǎn)業(yè)化栽培提供參考[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材 料

白及[Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.]飽滿種子。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

AIR TECH超凈工作臺(tái)，立式壓力蒸汽滅菌鍋，EL電子天平，滅菌器等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、噻二唑苯基脲(TDZ)等。

1.2 方 法

1.2.1 種子滅菌與誘導(dǎo)

取白及蒴果，用洗潔精水清洗表面污垢，流水沖洗5～8 min，再用75%酒精表面滅菌40 s，然后在0.1%的氯化汞溶液中分別滅菌8，12，15 min，無菌水沖洗3～5次。最后在超凈工作臺(tái)上，用消毒好的解剖刀剖開蒴果，并用解剖刀取出種子均勻接種于MS培養(yǎng)基上，將播種好的培養(yǎng)瓶放到培養(yǎng)室中。

1.2.2 叢生芽增殖

白及種子發(fā)芽后，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，待芽長至2 cm以上時(shí)，于無菌條件下，切取長約1.5 cm的單苗轉(zhuǎn)接至不同的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每一處理接種24個(gè)芽外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d進(jìn)行觀察。

叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的TDZ、6-BA、IAA進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.2.3 生根誘導(dǎo)

當(dāng)叢生芽長到5～7 cm時(shí)，將其切成單芽接種于不同濃度的生根培養(yǎng)基中，每一處理接種24個(gè)單苗，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后觀察生根情況。

生根培養(yǎng)基以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方分別為：1/2 MS+IBA 0.5 mg/L、1/2 MS+NAA 0.5 mg/L、1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L、1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。

1.2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度約2 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

近年來，政府做了很多努力，企業(yè)也有諸多進(jìn)步，但消費(fèi)者對(duì)食品安全的感知仍有待加強(qiáng)，這是食品安全領(lǐng)域的重要議題。有社會(huì)學(xué)家認(rèn)為，不科學(xué)的信息帶給消費(fèi)者的傷害遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真正的食品安全問題。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)種子滅菌效果的影響

種子滅菌分別設(shè)置3個(gè)時(shí)間處理，滅菌后播種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)， 10 d后觀察到種子變?yōu)榫G色小球體狀，即原球莖，繼續(xù)培養(yǎng)30～50 d，原球莖不斷繁殖增多(見圖1)。

圖1 白及種子萌發(fā)

由表1可以看出，滅菌12 min效果較好，萌發(fā)率最高，為84.44%。滅菌時(shí)間為8 min時(shí)，滅菌時(shí)間短，污染率高，存活率比較低；隨著滅菌時(shí)間的延長，在12 min時(shí)，白及種子污染率降低，存活率有所上升，萌發(fā)率達(dá)到所有處理中的最高值；當(dāng)滅菌時(shí)間延長至15 min時(shí)，污染率最低，為10.00%，但由于時(shí)間過長，導(dǎo)致部分種子喪失活力，萌發(fā)率逐漸下降，為67.5%。

表1 不同滅菌時(shí)間對(duì)種子消毒誘導(dǎo)效果的影響

滅菌時(shí)間(min)接種數(shù)(粒)污染數(shù)(粒)污染率(%)存活數(shù)(粒)成活率(%)萌發(fā)率(%)840615.003485.0072.501245511.114088.8984.441540410.003690.0067.50

2.2 不同激素對(duì)白及芽分化的影響

種子萌發(fā)后繼續(xù)在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，原球莖逐漸增多并開始長出嫩葉(見圖2)。

圖2 白及原球莖

待芽長至1.2～2 cm后，進(jìn)行分化增殖L 9(34)正交試驗(yàn)，從試驗(yàn)結(jié)果(表2)可以看出，較高濃度的TDZ對(duì)白及芽分化有顯著的作用。

表2 白及芽分化增殖正交試驗(yàn)結(jié)果

處理序號(hào)TDZ(mg/L)6-BA(mg/L)IBA(mg/L)接種芽數(shù)(個(gè))增殖芽數(shù)(個(gè))增值系數(shù)10.10.50.124351.4620.11.00.824582.4230.13.01.524612.5441.00.50.824451.8851.01.01.524672.7961.03.00.124753.1372.00.51.524783.2582.01.00.1241245.1792.03.00.8241034.29F值3714.620352251.534246575

圖3 白及芽分化培養(yǎng)

TDZ濃度為2.0 mg/L時(shí)增殖系數(shù)均高于其他處理。其中處理8效果最好(見圖3)，增殖系數(shù)達(dá)5.17，其次為處理9和處理7。觀察發(fā)現(xiàn)，處理8、處理9、處理7 3個(gè)處理苗長勢(shì)最好，株健壯、葉色嫩綠，處理1、處理2苗相對(duì)細(xì)弱，葉色黃。綜合各種情況來看，在芽分化培養(yǎng)基中,MS+TDZ 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+4.5 g/L瓊脂的激素組合效果最佳。

2.3 不同激素組合對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

當(dāng)叢生芽長到3～5 cm時(shí)，將其切成單芽接種于1/2 MS的生根培養(yǎng)基中(圖4)，培養(yǎng)30 d后觀察生根情況。

圖4 白及組培苗壯苗生根培養(yǎng)

從表3可看出，NAA更有利于白及的生根，以不同濃度的6-BA和NAA組合對(duì)生根效果均優(yōu)于單一的NAA或單一的6-BA，其中以1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L激素組合生根效果最好，生根率為87.50%，根長勢(shì)也最好，而1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的激素組合雖然生根率最高，但根較細(xì)弱，不利于煉苗移栽。

表3 不同激素組合對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

激素組合(mg/L)接種數(shù)(株)生根數(shù)(株)生根率(%)根長勢(shì)1/2MS+NAA0.5241979.17+++1/2MS+6-BA0.5241666.67++1/2MS+NAA0.5+6-BA0.1242187.50++++1/2MS+NAA0.5+6-BA0.5242291.67+++

注：++++表示長勢(shì)最好；+++表示長勢(shì)較好；++表示長勢(shì)一般。

2.4 煉苗與移栽

當(dāng)白及組培苗在生根培養(yǎng)基上根長有3條以上，苗高5～7 cm，且葉色濃綠、生長健壯時(shí)，打開培養(yǎng)瓶，并注入少量水淹沒培養(yǎng)基，于室內(nèi)自然光下煉苗1周，用鑷子小心取出試管苗，洗凈培養(yǎng)基后移栽至基質(zhì)比例為泥炭土∶蕨根∶木屑=2∶1∶1的基質(zhì)中，基質(zhì)以疏松透氣、排水良好、不易發(fā)霉為宜。根據(jù)需要每周噴施1～2次10倍稀釋的MS大量元素營養(yǎng)液，移至遮陽蔭棚培養(yǎng)，視基質(zhì)的干濕度噴霧補(bǔ)水。

移栽至蔭棚2個(gè)月后，白及組培苗成活率為85.7%。

3 討 論

白及種子自然萌發(fā)率極低，采取人工繁育是提高白及產(chǎn)量的有力措施，但現(xiàn)在人工繁育的常規(guī)方法大多以分株為主，即將塊莖分切成小塊種植，在人工栽培條件下，1個(gè)塊莖每年能形成1～3 個(gè)新塊莖，繁殖系數(shù)、組培苗移栽成活率均較低，苗質(zhì)量差，大面積發(fā)展供種困難，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

在白及滅菌及誘導(dǎo)過程中，在MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可萌發(fā)，細(xì)胞分裂素TDZ、6-BA和IBA組合可促進(jìn)原球莖的誘導(dǎo)和增殖，且TDZ對(duì)幼苗的分化也有極顯著的影響[6]。

從不同濃度的生長素對(duì)白及試管苗生根的影響上看，NAA的生根效果較好，說明天然生長素NAA具有良好的促進(jìn)白及試管苗生根的作用，改變6-BA的濃度后發(fā)現(xiàn)，雖然6-BA對(duì)白及的生根率有促進(jìn)作用，但是若6-BA濃度過大，則會(huì)使白及根過細(xì)，不利于移栽，故在使用6-BA時(shí)應(yīng)控制其濃度[7-9]。

參考文獻(xiàn):

[1]劉逢芹,夏麗婭.中藥白芨的現(xiàn)代研究概況[J].山東醫(yī)藥工業(yè),2009,19(5):32-33.

[2]宋立人,洪恂,丁緒亮,等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典(卷1)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.

[3]王倩,李東華,李繼坤.白及膠對(duì)體外培養(yǎng)兔膽管成纖維細(xì)胞形態(tài)及活性的影響[J].河北中醫(yī),2007,29(8):752-753.

[4]Michinori K,Noriko S,Miho Y,et al.Application studies of Rhizoma Bletillae (rhizomes of Bletilla striata) on atopic dermatitis[J].Nature medicine,2003,57(2):55-60.

[5]陳玉,張曉芳,朱劍東.中藥白芨對(duì)變鏈菌產(chǎn)酸和黏附影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2008,18(7):390-393.

[6]葉靜,鄭曉君,管常東,等.白芨的無菌萌發(fā)與組織培養(yǎng)[J].云南大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,32(S 1):422-425.

[7]趙漫麗,黃春球,李明靜,等.添加劑對(duì)白芨組培的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,26(6):821-827.

[8]鄒娜,李意,連芳青.優(yōu)良觀賞藥用地被植物——白芨組織培養(yǎng)及快速繁殖研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(5):950-955.

[9]張燕,黎斌,李汝娟,等.白芨種子的無菌萌發(fā)過程觀察和組培快繁研究[J].北方園藝,2013(3):158-160.