王洪斌 成群 謝冰倩 高力 丁浚哲 韓秉言

摘要：以2種海洋微藻的生長量、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）為檢測指標，研究海水小球藻（Chlorella vulgaris）和塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）對苯并[k]熒蒽的致毒脅迫的生理響應(yīng)，揭示出多環(huán)芳烴化合物對水環(huán)境污染的重要性。結(jié)果顯示，苯并[k]熒蒽對2種海洋微藻生長都存在抑制作用，海水小球藻的抑制率最高達62%，并存在劑量效應(yīng)；適當(dāng)濃度的苯并[k]熒蒽對塔胞藻生長有短時刺激作用，高濃度的苯并[k]熒蒽對塔胞藻有強烈的抑制作用，其最大抑制率達到89%。添加固定濃度（9 μg/L）苯并[k]熒蒽處理2種微藻，海水小球藻體內(nèi)ACP活性至72 h達最大值，與對照組相比，增加32%，塔胞藻48 h達到最大，升高105%；AKP活性變化趨勢與ACP活性基本一致；海水小球藻CAT活性至72 h達到最大值，是對照組的2.3倍，塔胞藻CAT活性至48 h即達最高，為對照組的2.5倍；2種微藻MDA含量隨著苯并[k]熒蒽暴露時間的增加而升高，與對照組相比，海水小球藻和塔胞藻在72 h MDA含量分別升高73%、81%；苯并[k]熒蒽對海洋微藻的致毒效應(yīng)存在種屬差異，對塔胞藻的致毒效應(yīng)大于海水小球藻。

關(guān)鍵詞：苯并[k]熒蒽；海水小球藻（Chlorella vulgaris）；塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）；致毒脅迫效應(yīng)

中圖分類號：TQ450.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）07-0036-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.07.008

Responses of Chlorella vulgaris and Pyramidomonas delicatula to the Toxic Effects of Benzo [k] Fluoranthene in Water Environment

WANG Hong-bin1，CHENG Qun1，XIE Bing-qian1，GAO Li1，DING Jun-jie2，HAN Bing-yan2

（1.College of Marine Life and Fisheries，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；

2.Jiangsu Xinhai Senior High School，Lianyungang 222005，Jiangsu，China）

Abstract： In this paper，the growth of two kinds of marine microalgae，acid phosphatase（ACP），alkaline phosphatase （AKP），catalase（CAT） and malondialdehyde（MDA） were used as indicators to study the responses of Chlorella vulgaris and Pyramidomonas delicatula to the toxic effects of benzo[k] fluoranthene in water environment and to reveal the importance of polycyclicaromatic-hydrocarbons for water pollution. The results showed that benzo[k] fluoranthene had inhibitory effect on the growth of two kinds of marine microalgae， and the inhibition rate of benzofluoranthene to C. vulgaris was up to 62%，and there was dose effect. The proper concentration of benzo[k] fluoranthene had a short time stimulating effect on P. delicatula，while high concentration of benzo[k] fluoranthenes had a strong inhibitory effect on P. delicatula，and its maximum inhibition rate was 89%. Two kinds of microalgae were prepared by adding fixed concentration（9 μg/L） of benzo[k] fluoranthene，the results showed the ACP of C. vulgaris reached the maximum at 72 h，which was 32% higher than that of the control group，while the ACP activity of P. delicatula reached the maximum at 48 h and increased by 105%. The trend of AKP activity was consistent with that of ACP. The CAT activity in C. vulgaris reached the maximum at 72 h，which was 2.3 times higher than that in the control group，and the activity of CAT was up to 48 h，which was 2.5 times of that of the control group. The content of MDA in two kinds of microalgae increased with the exposure time of benzo[k] fluoranthene. Compared with the control group，the contents of MDA in C. vulgaris and P. delicatula were increased by 73% and 81% at 72 h respectively. There was a difference in the toxic effects of benzo[k] fluoranthene on marine microalgae，and the toxic effects on P. delicatul were serious on C. vulgaris.

Key words： benzo[k] fluoranthene； Chlorella vulgaris； Pyramidomonas delicatula； toxic effects

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中含有兩個或兩個以上苯環(huán)的碳氫化合物，是一種廣泛分布的持久性環(huán)境污染物，形成于所有有機物質(zhì)的高溫分解過程[1]，例如煤、石油、汽油以及木材的不完全燃燒[2]。多環(huán)芳烴廣泛分布在環(huán)境介質(zhì)當(dāng)中，雖然其含量較低，但可以通過水質(zhì)、大氣、土壤、食物等多種有效途徑進入人體并富集，具有致癌變、致畸變、致突變的三致作用，還具有高毒性、低流動性、難降解性[3]，是誘導(dǎo)人類癌癥的重要環(huán)境污染物之一，引起了各界學(xué)者及環(huán)境保護界人士的廣泛關(guān)注。美國環(huán)保局[3]先后確定出16種PAHs作為優(yōu)先控制污染物，其中苯并[k]熒蒽（Benzo[k] fluoranthene，BkF）等7種多環(huán)芳烴具有致癌性質(zhì)[4]。多環(huán)芳烴廣泛分布在中國海洋近岸的水體和地質(zhì)中，丘耀文等[5]對深圳灣海域多環(huán)芳烴含量的分析發(fā)現(xiàn)，2004年2月深圳灣海水中多環(huán)芳烴總含量為（69.4±24.7） ng/L，而且在1948-2004年，深圳海灣柱狀沉積物中PAHs的濃度總體上呈上升趨勢。苯并[k]熒蒽是一種較為典型且具有代表性的PAHs，它對近海海域造成的污染已經(jīng)引起了人們的高度重視。

微藻在海洋生物中所占的比重約為40.86%[6]，其固定碳的量約占全球有機物的50%[7]，藻類作為各大類水體中重要的初級生產(chǎn)者，在整個生態(tài)系統(tǒng)中有著舉足輕重的地位[8]。而苯并[k]熒蒽可以通過各種途徑進入水體，藻類則會首先遭受其毒害作用。本研究從浮游藻類的視角，通過研究海水小球藻（Chlorella vulgaris）和塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）對苯并[k]熒蒽的致毒脅迫的生理響應(yīng)，為多環(huán)芳烴化合物對水環(huán)境污染的危害程度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海水小球藻和塔胞藻藻種均由淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院藻類實驗室保存；本試驗中所用海水均取自江蘇省連云港市連島海域漲潮時，海水鹽度為31.00‰～32.00‰，經(jīng)醋酸纖維素薄膜過濾后，于121 ℃下，高壓滅菌20 min后備用；苯并[k]熒蒽購自上海源葉生物有限公司（純度為98%）；酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；微藻培養(yǎng)采用通用的f/2營養(yǎng)液；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)及微藻細胞破碎 250 mL的三角燒瓶中加入150 mL的f/2營養(yǎng)液和10 mL的藻種，混合均勻，置于光照培養(yǎng)箱中進行封閉式培養(yǎng)，光照度為3 000 lx，培養(yǎng)溫度為（22±1） ℃，明暗周期為12 h/12 h。培養(yǎng)過程中每天定時搖動3次，搖瓶過程中隨機調(diào)換位置，以避免光照不均。

量取待測藻液20 mL，5 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀物加入10 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），采用超聲波破碎藻細胞（破碎條件為功率300 W，時間10 min，超聲破碎3 s、間隔7 s循環(huán)），鏡檢無完整細胞，5 000 r/min離心10 min，取上清液用作檢測ACP、AKP、CAT活性以及MDA含量用。

1.2.2 甲醇對微藻生長量的影響 苯并[k]熒蒽溶液是用甲醇配制而成，所以在研究苯并[k]熒蒽對海洋微藻影響時可能會受到甲醇的干擾。在藻類生長至對數(shù)生長期時加入與苯并[k]熒蒽等體積梯度的純甲醇溶液，2種微藻試驗組分別加入0、100、200、300、400、500 μL的甲醇，吸光度法（680 nm）檢測其生長量，24 h測定一次，直至120 h，試驗設(shè)置3個平行。

1.2.3 苯并[k]熒蒽對微藻生長量的影響 150 mL對數(shù)期微藻藻液，添加不同濃度梯度苯并[k]熒蒽，參考文獻[9]，2種微藻試驗組分別加入0、100、200、300、400、500 μL的苯并[k]熒蒽甲醇溶液，對應(yīng)濃度為0、3、6、9、12、15 μg/L；吸光度法（680 nm）檢測其生長量，24 h測定一次，直至120 h，試驗設(shè)置3個平行。

1.2.4 ACP、AKP、CAT活性和MDA含量的測定

對數(shù)期微藻，添加0、9 μg/L的苯并[k]熒蒽，對其ACP、AKP、CAT活性和MDA含量進行測定，時間間隔 24 h，直至120 h，試驗設(shè)置3個平行。

ACP、AKP、CAT活性和MDA含量的測定按照試劑盒的說明書進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醇對2種海洋微藻生長量的影響

按“1.2.2”方法，海水小球藻和塔胞藻試驗組中分別添加與苯并[k]熒蒽相同體積的甲醇溶液，其結(jié)果見圖1。由圖1可知，甲醇溶液對2種海洋微藻的生長無影響，試驗組與對照組均生長良好，增長趨勢基本一致，由此表明，由甲醇配制出的苯并[k]熒蒽溶液中的甲醇載體未對本試驗設(shè)計產(chǎn)生干擾。

2.2 苯并[k]熒蒽對2種海洋微藻生長量的影響

苯并[k]熒蒽對2種微藻生長量的影響見圖2。由圖2A可知，隨著海水小球藻培養(yǎng)時間延長，未加苯并[k]熒蒽的對照組具明顯增長趨勢，苯并[k]熒蒽的暴露濃度在海水小球藻生長前期基本無影響，48 h后，試驗組有明顯被抑制現(xiàn)象，生長緩慢，且隨著苯并[k]熒蒽濃度增大抑制作用加強，至120 h，濃度為3、6、9、12、15 μg/L苯并[k]熒蒽對海水小球藻的抑制率分別為50%、51%、51%、58%、62%，抑制率均大于50%，并存在劑量效應(yīng)，經(jīng)t檢驗分析，5個濃度試驗組均與對照組存在極顯著差異（P<0.01）。苯并[k]熒蒽處理塔胞藻120 h后的生長量見圖2B，在試驗前期（24 h前），暴露在苯并[k]熒蒽中的塔胞藻同對照組基本無差別，均生長良好，48 h后，苯并[k]熒蒽對塔胞藻有明顯抑制生長現(xiàn)象，與海水小球藻相比，抑制存在波動性，表明適當(dāng)濃度的苯并[k]熒蒽對塔胞藻生長有短時刺激作用，至120 h，濃度為3、6、9、12、15 μg/L苯并[k]熒蒽對塔胞藻的抑制率分別為63%、58%、70%、76%及89%，后期及高濃度的苯并[k]熒蒽具強烈的毒性效應(yīng)，經(jīng)t檢驗分析，5個濃度試驗組均與對照組存在極顯著差異（P<0.01）。

2.3 苯并[k]熒蒽對2種海洋微藻ACP活性的影響

按“1.2.4”方法所述，添加9 μg/L苯并[k]熒蒽處理2種微藻，ACP活性變化見圖3，隨著培養(yǎng)時間的遞增，海水小球藻體內(nèi)ACP活性逐漸增高，持續(xù)至72 h達最大值，增加32%，后緩慢降低，120 h恢復(fù)對照組水平；而塔胞藻隨著培養(yǎng)時間延長，24 h后開始升高，48 h達到最大，與對照組相比，升高105%，經(jīng)t檢驗分析，與對照組差異極顯著（P<0.01）。

2.4 苯并[k]熒蒽對2種海洋微藻AKP活性的影響

由圖4可知，苯并[k]熒蒽處理2種微藻的AKP活性變化趨勢與ACP基本一致，就整體趨勢而言，試驗初期，海水小球藻體內(nèi)的AKP活性較穩(wěn)定，直至48 h后，小球藻體內(nèi)AKP才略有增加，海水小球藻培養(yǎng)至72 h，體內(nèi)AKP活性最高，與對照組相比，升高49%，120 h后恢復(fù)到對照組水平；塔胞藻體內(nèi)AKP活性隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸升高，24 h即增加49%，48 h即達最高值，與對照組相比，升高123%，經(jīng)t檢驗分析，與對照組差異極顯著（P<0.01），72 h AKP活性仍然高出對照組近50%，120 h后試驗組與對照組基本無差異。

2.5 苯并[k]熒蒽對2種海洋微藻CAT活性的影響

苯并[k]熒蒽處理2種微藻的CAT活性變化結(jié)果見圖5，24 h CAT活性即迅速升高，2種微藻體內(nèi)CAT活性增加與苯并[k]熒蒽暴露時間呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢，海水小球藻增加趨勢持續(xù)至72 h達到最大值，是對照組的2.3倍，經(jīng)t檢驗分析，與對照組差異極顯著（P<0.01），自96 h開始，CAT活性降低，120 h恢復(fù)至對照組水平；隨著培養(yǎng)時間的延長，塔胞藻CAT活性自24 h急劇升高，趨勢較海水小球藻更為明顯，至48 h即達最高值，為對照組的2.5倍，經(jīng)t檢驗分析，與對照組差異極顯著（P<0.01），CAT活性在高位持續(xù)至96 h，120 h后，試驗組又基本恢復(fù)至對照組水平。

2.6 苯并[k]熒蒽對2種海洋微藻MDA含量的影響

苯并[k]熒蒽處理2種微藻MDA含量變化見圖6，隨著培養(yǎng)時間的延長，2種微藻MDA含量隨著苯并[k]熒蒽暴露時間的增加而升高，與對照組相比，海水小球藻在24、48、72、96 h MDA含量分別升高59%、70%、73%、72%，經(jīng)t檢驗分析，與對照組差異極顯著（P<0.01），繼續(xù)培養(yǎng)至120 h后，海水小球藻MDA恢復(fù)對照組水平；塔胞藻MDA含量24 h即開始劇烈升高，在24、48、72、96 h MDA含量分別升高55%、68%、81%、61%，經(jīng)t檢驗分析，與對照組差異極顯著（P<0.01），與海水小球藻不同，塔胞藻繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，其MDA含量依然高出對照組65%。

3 討論

苯并[k]熒蒽對2種海洋微藻生長都存在抑制作用，本研究設(shè)計的所有質(zhì)量濃度試驗組對海水小球藻的抑制率均大于50%，最高達62%，并存在劑量效應(yīng)；與對照組相比，后期及高濃度的苯并[k]熒蒽具強烈的毒性效應(yīng)，生長量的變化與MDA含量檢測結(jié)果相一致，張智華等[10]研究也指出，低濃度的蒽菲芘（50 μg/L）對小新月菱形藻具有促進作用，而高濃度的蒽菲芘（100～200 μg/L）對小新月菱形藻生長具有抑制作用，本試驗結(jié)果也呈現(xiàn)類似結(jié)論。苯并[k]熒蒽的暴露濃度對于海水小球藻的作用效果沒有明顯差異性，而塔胞藻的作用效果具有波動性，表明適當(dāng)濃度的苯并[k]熒蒽對塔胞藻生長有短時刺激作用，高濃度的苯并[k]熒蒽對塔胞藻有強烈的抑制作用，其最大抑制率達到89%。苯并[k]熒蒽對2種微藻的致毒脅迫存在種屬差異性。

本試驗設(shè)計添加固定濃度（9 μg/L）苯并[k]熒蒽處理2種微藻，隨著培養(yǎng)時間的遞增，海水小球藻體內(nèi)ACP活性至72 h達最大值，增加32%，而塔胞藻隨著培養(yǎng)時間延長，48 h達到最大，與對照組相比，升高105%。對2種微藻AKP活性的影響趨勢與ACP基本一致；2種微藻體內(nèi)CAT活性增加與苯并[k]熒蒽暴露時間呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢，小球藻增加趨勢持續(xù)至72 h達到最大值，與對照組相比，是其2.3倍，塔胞藻CAT活性自24 h急劇升高，趨勢較小球藻更為明顯，至48 h即達最高值，為對照組的2.5倍，CAT活性在高位持續(xù)至96 h，ACP、AKP和CAT活性變化說明2種海洋微藻對苯并[k]熒蒽的致毒脅迫產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng)，短時間內(nèi)刺激ACP、AKP和CAT活性升高，特別是CAT活性變化明顯，結(jié)果與生長量的變化一致。

張智華等[10]也指出，小新月菱形藻的CAT活性和MDA含量在蒽菲芘作用下會有不同程度的升高，細胞損傷加劇。任加云等[11]、沈忱[12]指出進入生物體中的污染物在分解代謝過程中能夠形成多種中間產(chǎn)物，并產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，造成生物體的氧化損傷，一些抗氧化防御系統(tǒng)能夠轉(zhuǎn)化超氧陰離子自由基，從而使得機體免受損傷。本試驗苯并[k]熒蒽脅迫2種微藻，2種微藻MDA含量隨著苯并[k]熒蒽暴露時間的增加而升高，與對照組相比，小球藻在72 h MDA含量升高73%，繼續(xù)培養(yǎng)至120 h后，小球藻MDA含量恢復(fù)對照組水平；塔胞藻24 h即開始劇烈升高，塔胞藻在72 h MDA含量分別升高81%，與小球藻不同，塔胞藻繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，其MDA含量依然高出對照組65%，可能由于苯并[k]熒蒽對塔胞藻致毒效應(yīng)強，塔胞藻120 h后本身藻體活性減弱，死亡率加劇而導(dǎo)致MDA含量仍然維持高位。王麗平等[9]也指出，熒蒽脅迫對藻細胞的膜脂質(zhì)過氧化作用有明顯增強的跡象，藻細胞的MDA含量對苯并[k]熒蒽毒性較為敏感，是個潛在的有價值的參考指標。

本試驗從浮游藻類的視角，通過研究海水小球藻和塔胞藻的生長、部分抗氧化酶活性及MDA含量對苯并[k]熒蒽的致毒脅迫的響應(yīng)，旨在為揭示多環(huán)芳烴化合物對水環(huán)境污染的重要性，并研究海洋微藻在水環(huán)境污染治理及修復(fù)中的潛在應(yīng)用。

參考文獻：

[1] HONG D D，KIM T H，HWANG M S，et al. Effects of salinity on chlorophyll fluorescence from Porphyra thalli and comparison of species with different intertidal distribution[J].Fishery Aquaculture Technology，1998，1（1）：122-128.

[2] 黃 仿，武 寶.熱脅對球等鞭金藻作用機制的葉綠素?zé)晒獾难芯縖J].廣西師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1995，13（2）：72-76.

[3] TERAWAKI T，YOSHIKAWA K，YOSHIDA G. Ecology and restoration techniques for Sargassum beds in the Seto Inland Sea，Japan[J].Marine Pollution Bulletin，2003，47（1）：198-201.

[4] 董繼元，王式功，尚可政.黃河蘭州段多環(huán)芳烴生態(tài)風(fēng)險的初步評價[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，28（9）：1892-1897.

[5] 丘耀文，張 干，郭玲利，等.深圳灣生態(tài)系統(tǒng)多環(huán)芳烴（PAHs）特征及生態(tài)危害[J].環(huán)境科學(xué)，2007，28（5）：1054-1061.

[6] 劉新寧.重金屬離子處理塔胞藻生物學(xué)效應(yīng)的研究[D].濟南：山東大學(xué)，2006.

[7] 馮一寧，劉均洪.轉(zhuǎn)基因微藻的研究進展[J].江蘇化工，2004， 32（5）：15-18.

[8] 王洪斌，花文鳳，李信書，等.硝基苯和間苯二酚對3種海洋微藻的毒理效應(yīng)[J].海洋科學(xué)，2013，37（5）：39-44.

[9] 王麗平，鄭丙輝，孟 偉.熒蒽對兩種海洋硅藻生長、SOD活力和MDA含量的影響[J].海洋通報，2008，27（4）：53-58.

[10] 張智華，蔡恒江，張俊新.蒽、菲、芘對小新月菱形藻的毒性研究[J].廣州化工，2015，43（19）：95-98.

[11] 任加云，潘魯青，苗晶晶.苯并（a）芘和苯并（k）熒蒽混合物對櫛孔扇貝毒理學(xué)指標的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，26（7）：1180-1186.

[12] 沈 忱.苯并（a）芘對海洋微藻毒性和生理的研究[D].山東青島：中國海洋大學(xué)，2012.