王軍鋒，李思佳，王曉蘭

(陜西學(xué)前師范學(xué)院 化學(xué)與化工系，陜西 西安 710100)

石榴，營養(yǎng)豐富，其籽粒味道甘美，且石榴含有豐富的維生素C。維生素C，又稱L-抗壞血酸，是人體必需營養(yǎng)素之一，缺乏維生素C會致使壞血病，因此，必須從食物中獲取。目前測量維生素C的方法主要有高效液相色譜法[1]；紫外分光光度法；碘量法；熒光法[2]；電化學(xué)法[3]，滴定法、酶法；以及2、4-二硝基苯肼法等，除此之外Deutsch和Weeks曾經(jīng)報道過一種檢測維生素C的熒光分析法(OPDA)，并被指定為維生素C的經(jīng)典熒光分析法[4]。在該方法中，維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結(jié)合生成熒光產(chǎn)物，通過對該熒光產(chǎn)物的檢測實現(xiàn)對維生素C的定量分析[5]。本文基于維生素C在草酸作溶劑不外加增敏劑的條件下經(jīng)Cu2+氧化后與鄰苯二胺反應(yīng)生成一種較強的熒光物質(zhì)，通過對體系熒光強度的測定進行維生素C的定量分析，其熒光強度與維生素C的濃度成正比，該方法所涉及的體系穩(wěn)定性好，據(jù)此優(yōu)化了熒光測定維生素C的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

日立F-7000熒光分光光度計；上海F-960熒光分光光度計；PHS -3C精密pH計，上海雷磁儀器廠； 水浴鍋。

1.1.2 試劑

抗壞血酸(分析純)；1%草酸溶液；CuSO4溶液：0.04mg/mL；維生素C標準儲備液：1mg/mL，2～8℃避光保存；NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液；HAc-NaAc緩沖溶液；NaOH-KHPO4緩沖溶液；KH2PO4- Na2HPO4緩沖溶液；500g/L乙酸鈉溶液；0.2g/L鄰苯二胺溶液(臨用前配制)；30g/L硼酸-500g/L乙酸鈉溶液(臨用前配制)；偏磷酸-乙酸溶液；試驗用水為蒸餾水。

1.2 原理

維生素C自身沒有熒光，樣品中還原性抗壞血酸(維生素C)在草酸溶液后溶解后經(jīng)氧化劑(Cu2+)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，再與鄰苯二胺(OPDA)反應(yīng)產(chǎn)生具有熒光的喹喔啉，其熒光強度與維生素C的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。因果蔬中丙酮酸也可與鄰苯二胺反應(yīng)生成熒光化合物，加入硼酸后脫氫抗壞血酸與硼酸可構(gòu)成絡(luò)合物而不能跟鄰苯二胺反應(yīng)，而丙酮酸依然可以和鄰苯二胺反應(yīng)，所以用加入硼酸后測出的熒光強度為空白對照，以此除清樣品中雜質(zhì)所造成的干擾。

1.3 實驗方法及過程

在25mL容量瓶中依次加入1mL的維生素C標準溶，4mL CuSO4溶液，4mL緩沖溶液，氧化五分鐘后加入3mL鄰苯二胺溶液用蒸餾水定容，搖勻。在25℃恒溫水浴中加熱30min，將溶液冷卻至室溫后，在激發(fā)波長為355nm，在發(fā)射波長425nm處，測定其熒光強度F，以不含維生素C的試劑為對照組，標準系列熒光強度分別減去標準對照熒光強度為縱坐標，所對應(yīng)的抗壞血酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線。記錄直線回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 試劑加入順序

按照試驗方式，在試劑加入量無差別的情況下，查驗試劑的不同加入順序，測定其熒光強度，按照加入試劑的排列順序不同，選擇熒光強度最好最不變的一項為最佳加入試劑順序。測得當λn=415，Y=2,sens=2各試劑用量均為1mL，在25mL容量瓶中依次加入維生素C標準溶，CuSO4溶液，NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，鄰苯二胺溶液時體系的熒光強度最大。

2.2 氧化劑濃度及用量的選擇

維生素C極易被氧化，因此，氧化劑Cu2+濃度對實驗的影響很大。圖1中為Cu2+濃度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.20mg/mL范圍內(nèi)轉(zhuǎn)變時對系統(tǒng)熒光強度的影響，由圖知當Cu2+濃度小于0.04時體系的熒光強度呈上升趨勢，說明仍在繼續(xù)氧化，而在Cu2+濃度大于0.04時，體系的熒光強度呈降落去向，Cu2+濃度為0.04時系統(tǒng)的熒光強度最大，是以選定該濃度為最好氧化劑濃度。

圖1 氧化劑濃度對體系熒光強度的影響

2.3 pH值與緩沖溶液的影響

緩沖溶液不同對系統(tǒng)的熒光強度影響有顯著差異，實驗如下pH值=6.0的緩沖溶液：NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液、HAc - NaAc緩沖溶、NaOH - KHPO4緩沖溶液、KH2PO4- Na2HPO4緩沖溶液，在其他試劑加入量無差別的情況下，各加入1mL上述緩沖溶液，結(jié)果表明緩沖溶液選擇NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀時該系統(tǒng)的熒光強度最大。

溶液的pH值對系統(tǒng)的熒光強度影響很大，配制pH值=5.0～6.0的NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，當pH值=5.6且用量為4mL時熒光強度到達最大值且比較穩(wěn)定。

2.4 加熱溫度和加熱時間對熒光強度的影響

室溫下一般的氧化反應(yīng)大多數(shù)是慢反應(yīng)，而溫度對體系熒光強度也有較大影響，在他試劑加入量相同的條件下，設(shè)置不同的加熱溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)測定熒光強度，再設(shè)置不同的加熱時間(10min、20min、30min、40min、50min)測定熒光強度，根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)選擇最佳加熱溫度和加熱時間。當水浴溫度為25℃時恒溫30min時系統(tǒng)的熒光強度呈現(xiàn)最大值。

2.5 氧化時間對熒光強度的影響

實驗中測定了不同氧化時間和不同反應(yīng)時間下的熒光值，結(jié)果顯示，當t≥10min時，氧化劑氧化基本完成而且趨于穩(wěn)定，因此選定氧化時間為10min進行氧化。將體系放置不同的時間進行梯度實驗，在相同的實驗條件下，每隔10min測量一次，做10組，分別測量其熒光強度，結(jié)論：體系熒光強度在20min左右可達到最大值，為了使反應(yīng)徹底完全，因此選定放置時間為25min。

2.6 鄰苯二胺濃度對熒光強度的影響

鄰苯二胺的濃度是實驗中的重要條件，在其他前提條件穩(wěn)定的情況下，對鄰苯二胺的濃度設(shè)置梯度(采用0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30g/L)，在此條件下逐個測定系統(tǒng)熒光強度，由圖2可知，當鄰苯二胺濃度>0.15g/L時，系統(tǒng)的熒光強度趨于穩(wěn)定，為了使DHAA徹底反應(yīng)，選擇0.2g/L為最好鄰苯二胺濃度。

圖2 鄰苯二胺濃度對體系熒光強度的影響

2.7 穩(wěn)定性實驗

在放置時間為20min左右時測定其穩(wěn)定值，每隔10min一次，測20組，得出結(jié)論：系統(tǒng)熒光強度可不變10min，見圖3。

圖3 反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響

2.8 激發(fā)和發(fā)射波長的選擇

對維生素C 標準溶液和空白試劑溶液按上述方法反應(yīng)后的熒光物,分別在290～330nm，350～500nm內(nèi)掃描得到激發(fā)和發(fā)射光譜，如圖4所示，由圖4中可以看出。在激發(fā)波長為355nm，發(fā)射波長為426nm時，系統(tǒng)處于最好熒光強度，空白試劑的熒光值比較穩(wěn)定，則選擇激發(fā)波長為355nm，發(fā)射波長為426nm。

圖4 激發(fā)波長和發(fā)射波長

2.9 標準曲線的繪制

圖5為抗壞血酸濃度和其相對熒光強度之間的曲線圖。

圖5 工作曲線

從圖5中可以看出維生素C在濃度為0.002～4μg/mL的范圍內(nèi)與系統(tǒng)的相對熒光強度值Δ F呈現(xiàn)杰出的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=74.481x+8.5215，R2=0.9902。

2.10 測定樣品

將石榴樣品按上述方式測定后，測定熒光強度F，同時測定樣品空白溶液熒光強度F0,并得出實際的熒光強度ΔF=F-F0。根據(jù)維生素C 的標準曲線，得出石榴中維生素C 的含量。

3 結(jié)論

本文實驗了熒光法測定石榴中維生素C的含量的檢測方法，維生素C在0.002～4μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限較低，采用熒光法測定石榴中維生素C含量，具有簡便，快速，靈敏度高，結(jié)果準確等優(yōu)點，可以滿足實際測量的需要。

測量樣品結(jié)果顯示同一顆石榴，背陰面與朝陽面向比，其熒光強度有所減弱，即朝陽面所測熒光強度較強，所以，石榴的朝陽面果實其維生素含量高。

由于所取石榴均為陜西省西安市臨潼區(qū)所產(chǎn)，分別取三地樣品(斜口、胡王、秦陵)，實驗所得樣品熒光強度并無太大性差異，因此，此三地的石榴維生素含量均比較豐富，可以滿足人體對維生素的需求。

[1] 李圣男，蔡大川，鄭家概，等.HPLC法測定番石榴中總維生素C的含量[J].廣州化工， 2017,45(11):136-138.

[2] 崔 香，寇雪玲.熒光分析法測定枸杞中維生素C[J].青海師范大學(xué)學(xué)報，2009(2):58-60.

[3] 彭文峰,Seddon B J,張學(xué)記,等.平行雙鉑絲微電極用于鐵氰化鉀電流滴定法測定抗壞血酸的研究[J].分析化學(xué),1992,20(7):837-839.

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