李曉春 王莉芳 鄭旭 徐長根 馬麗
1 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 (陜西 西安 710065)2 咸陽市中心醫(yī)院藥學(xué)部 (陜西 咸陽 712000)
自2014年6月1日起開始施行的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》中明確提出國家對醫(yī)療器械按照風(fēng)險程度實行分類管理。第一類是風(fēng)險程度低,實行常規(guī)管理可以保證其安全、有效的醫(yī)療器械。第二類是具有中度風(fēng)險,需要嚴(yán)格控制管理以保證其安全、有效的醫(yī)療器械。第三類是具有較高風(fēng)險,需要采取特別措施嚴(yán)格控制管理以保證其安全、有效的醫(yī)療器械[1]。根據(jù)2017年8月頒布的醫(yī)療器械分類目錄,直腸黏膜修復(fù)敷料屬于無源植入器械中的組織工程支架材料,屬Ⅲ類器械[2]。按照GB/T系列標(biāo)準(zhǔn)[3-6]對直腸黏膜修復(fù)敷料進行了細胞毒性、遲發(fā)型過敏及刺激等生物學(xué)評價,以期為進一步的臨床研究提供依據(jù),現(xiàn)報道如下。
供試品:直腸黏膜修復(fù)敷料,A、B、C三個廠家生產(chǎn),共三批。
材料、藥品、試劑:①高密度聚乙烯,批號:K0M357,美國藥典委員會;②氯化鈉注射液,批號:160130 3G,西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司;③優(yōu)級胎牛血清,貨號:TBD21HY,天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;④RPMI培養(yǎng)基,批號:AB10125297,HyClone;⑤青鏈霉素混合液(100×),批號:20170503,Solarbio;⑥胰蛋白酶,批號:SLBP8607V,Sigma;⑦苯酚,批號:20160317,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
細胞及動物:①細胞株,L929細胞,武漢博士德生物工程有限公司。②白化豚鼠、新西蘭兔,由西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2014-001。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度22~26?C,相對濕度40%~70%,實驗動物使用許可證號:SYXK(陜)2013-00。
儀器:①電子天平,BS2202S,賽多利斯儀器有限公司;②生化培養(yǎng)箱,BSP-250,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;③低速臺式離心機,KA-1000,上海安亭科學(xué)儀器廠;④醫(yī)用凈化工作臺,SW-CJ-2F,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;⑤CO2培養(yǎng)箱,HF151,上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司;⑥倒置相差顯微鏡,XSZ-D2,重慶光學(xué)儀器廠。
1.2.1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗[4]
誘導(dǎo):試驗前剔除豚鼠背部被毛。豚鼠30只作為試驗組,5只作為對照組。取供試品用吸收性紗布浸透1mL,貼敷于如圖1所示誘導(dǎo)部位,紗布覆蓋,繃帶固定,貼敷6h。1周中連續(xù)3d重復(fù)該操作,同法操作3周。對照組以氯化鈉注射液同法操作。見圖1。
激發(fā):最后一次誘導(dǎo)后14d,對所有豚鼠于圖1中的激發(fā)部位進行激發(fā),方法同①,貼敷6h。24h后剔除激發(fā)部位及周圍被毛,溫水洗凈擦干,脫毛后至少2h,按表1對試驗部位評分,并于48h再次評分。見表1。
1.2.2 體外細胞毒性試驗(MTT法)[3,5,6]
試驗樣品及試液的制備:①供試液:無菌條件下將直腸黏膜修復(fù)敷料與含血清培養(yǎng)基按0.2g/mL的比例于37?C浸提24h后2000r/min離心3min,取上清。②陰性對照液:取高密度聚乙烯(厚度為1mm)36cm2,剪成5mm×25mm的小塊,加12mL細胞生長培養(yǎng)液,37?C浸提24h,過濾除菌。③陽性對照液:5g/L苯酚溶液,過濾除菌,現(xiàn)用現(xiàn)配。④空白對照液:同細胞生長培養(yǎng)液。
方法:取6塊96孔培養(yǎng)板,每板各設(shè)6孔,每孔接種100μL處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的L929細胞混懸液,密度為1×104個/mL。置5%CO2培養(yǎng)箱37?C培養(yǎng)24h后,棄去原生長培養(yǎng)液。1-3#板各加100μL供試液,作為供試品組;4#板加100μL空白對照液,作為空白對照組;5#板加100μL的陽性對照液,作為陽性對照組,6#板加100μL的陰性對照液,作為陰性對照組,置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。72h后,取出各板,置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),每孔加入20μL質(zhì)量濃度為5g/L的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體,每孔加入150μL DMSO,振蕩10min,在酶標(biāo)儀570nm和630nm波長下測定吸光度,按下式計算相對增值率(RGR)。
表1.Magnusson和Kligman分級
注:RGR——相對增值率,%;A——供試品組(陽性及陰性對照組)在570nm和630nm波長下的吸光度的差值;A0——空白對照組吸光度。
根據(jù)RGR按表2判定毒性反應(yīng)分級。見表2。
1.2.3 黏膜刺激試驗[4]
表2.細胞毒性反應(yīng)分級(%)
表3.口腔、陰莖、直腸和陰道組織反應(yīng)顯微鏡計分系統(tǒng)(分)
選取直腸無明顯刺激癥狀、無缺陷和無損傷的家兔12只,供試品組及對照組各3只。供試品組將受試物原液1mL注入至直腸內(nèi),對照組以氯化鈉注射液1mL同法處理。每隔24h連續(xù)重復(fù)上述操作,連續(xù)5d。觀察記錄會陰溢液、紅斑及刺激情況。給藥結(jié)束后解剖出直腸組織,觀察黏膜上皮組織。于注射部位取材,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,LEICA生物顯微鏡觀察。按表3記錄每只動物病理反應(yīng)評分,按表4進行刺激反應(yīng)程度分級。見表3、表4。
表4.刺激指數(shù)
于激發(fā)后24h及48h觀察,供試品組及對照組中豚鼠的反應(yīng)等級均為0,表明三批直腸黏膜修復(fù)敷料在本試驗條件下對豚鼠皮膚無致敏反應(yīng),結(jié)果見表5。
結(jié)果表明在本實驗室條件下,陽性對照組細胞毒性反應(yīng)級別為4級,陰性對照組細胞毒性反應(yīng)級別為0級,直腸黏膜修復(fù)敷料A和C的細胞毒性反應(yīng)級別≤2級,B的細胞毒性反應(yīng)級別≤1級,結(jié)果見表6。
病理檢查結(jié)果顯示:對照組黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整,固有層可見輕到中度炎細胞浸潤及極輕度水腫,未見明顯血管充血,平均刺激指數(shù)為3.33;試驗組黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整,固有層可見重度炎細胞浸潤,少數(shù)血管充血及極輕度水腫,平均刺激指數(shù)為試驗組(A)5.33,試驗組(B)6.67,試驗組(C)5.33。
結(jié)果表明在本實驗室條件下,三批直腸黏膜修復(fù)敷料均具輕度刺激,對照組具極輕度刺激。病理檢查結(jié)果見圖2,反應(yīng)計分及程度見表7。
表5.遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗結(jié)果
表6.細胞毒性試驗結(jié)果
表7.黏膜刺激性試驗結(jié)果(n)
圖2.直腸黏膜修復(fù)敷料病理切片圖
醫(yī)療器械的生物學(xué)評價是在器械應(yīng)用于人體之前先模擬體內(nèi)、體外生物學(xué)試驗,再根據(jù)實際需要進行動物體內(nèi)實驗,經(jīng)數(shù)據(jù)分析和信息匯總后進行安全性評估,最終對該器械應(yīng)用于人體的風(fēng)險性做出預(yù)判。其意義在于預(yù)測醫(yī)療器械在與人體接觸使用過程中的潛在危害,將風(fēng)險性減少到最低的程度,確保使用的安全性[7]。醫(yī)療器械的生物學(xué)評價是確保人體應(yīng)用安全的重要前提,但其本質(zhì)是一項預(yù)測性工作,由于體外與體內(nèi)的情況不能完全等同,動物與人體也存在差異,因此用體外試驗的結(jié)果來推測體內(nèi)的應(yīng)用狀況,用動物試驗得來的結(jié)果去推測人體應(yīng)用的安全與否,是有可能會出現(xiàn)某些偏差的[8]。正是由于醫(yī)療器械生物學(xué)評價的特殊性及局限性,所以不能簡單地只以某一項試驗結(jié)果就做出判斷,而是應(yīng)該建立在綜合考慮分析的基礎(chǔ)上去做整體評價。雖然現(xiàn)在業(yè)內(nèi)已有了一系列的評價標(biāo)準(zhǔn)及方法,但是由于材料科學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的迅猛發(fā)展,各種類型的醫(yī)用產(chǎn)品不斷問世,現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)或方法還不足以完全適應(yīng)安全性評價的需求,這將是當(dāng)下醫(yī)療器械的安全性評價領(lǐng)域需要面對和思考的問題。
本文綜合了GB/T16886及GB/T14233的系列標(biāo)準(zhǔn),對三批直腸黏膜修復(fù)敷料進行了生物安全性評價,結(jié)果均符合規(guī)定。初步認(rèn)為三批直腸黏膜修復(fù)敷料用于臨床是安全的。
[1]國務(wù)院.醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例[Z].2014-03-07.
[2]國家食品藥品監(jiān)督管理條例.醫(yī)療器械分類規(guī)則[Z].2015-07-14.
[3]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第12部分:樣品制備與參照樣品[S].2005:4-8.
[4]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗[S].2005:14-16,25-30.
[5]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第5部分:體外細胞毒性試驗[S].2003:84-88.
[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分:生物學(xué)試驗方法[S].1993:7-10.
[7]李學(xué)敏.膠原基復(fù)合組織修復(fù)材料的研制及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2007.
[8]孫皎.生物材料和醫(yī)療器械的生物學(xué)評價[J].中國醫(yī)療器械雜志,2003,27(1):1-3,8.